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自然免疫受容体TLR9活性化機構の構造生物学的研究

石田, 英子 東京大学 DOI:10.15083/0002002736

2021.10.27

概要

【背景】
　Toll-like receptors(TLR)は，病原体の分子パターンを認識して自然免疫を活性化させるI型膜貫通タンパク質である。TLR9は，エンドソームに局在し細菌やウイルス由来の一本鎖DNA(ssDNA)の非メチル化CpG配列(CpGモチーフ)を認識し，炎症性サイトカインやI型インターフェロンの産生を誘導する。TLRは一般的に単量体で存在し，リガンド結合によって二量体を形成することで活性化状態となりシグナルを伝達すると考えられている(図1)。これまでにTLR9とCpGモチーフをもつDNA(CpG DNA)との2:2複合体の結晶構造が解明されている(図2，文献1)。しかし，CpG DNA単独でのTLR9の二量体化は非常に弱く，実際のTLR9の活性化にはCpG DNAに加えて他の因子が介在している可能性が示唆された。最近の研究で，CpG DNAの5’末端側の配列がTCGあるいはTCCであるものは，そうでないものと比較してTLR9を効率的に活性化することが報告された(文献2,3)。これらの報告から，TLR9にはCpG DNAの結合部位とは異なる第2のDNA結合部位が存在し，2種類のDNAによってTLR9の活性が制御されていることが推測された。本研究では，TLR9の第2のDNA結合部位を同定し，結合するDNAの配列特異性および結合様式を示し，2種類のDNAが同時にTLR9に結合することでより効率的に活性化する機構を明らかにした。

【方法】
　ウマ，ウシ，マウス由来のTLR9の細胞外ドメイン全長のC末端にトロンビン認識配列およびprotein Aタグを付加したコンストラクトを用い，ショウジョウバエS2細胞で発現させた。培養上清からTLR9を高純度精製し，性状解析用サンプル(糖鎖非短縮)と結晶化用サンプル(糖鎖短縮)を得た。結晶の品質向上を目的として，ウマおよびウシTLR9は糖鎖生合成阻害剤キフネンシン存在下で培養し，精製時に酵素により糖鎖を短縮した。マウスTLR9はあらかじめ糖鎖結合可能部位に変異を導入して糖鎖付加を阻害し，性状解析用サンプルと同様に精製を行った。得られた結晶化用TLR9を用いて，CpG DNAと5’-TCGDNAとの共結晶化を行った。CpG DNAとしてAGGCGTTTTT配列のDNAを，第2の結合部位に結合するDNA(5’-TCGDNA)は，2番目のシトシン以外の塩基をさまざまな塩基に置換したDNAを結晶化に使用し，分解能1.81—2.70Åで構造決定した。また，等温滴定型カロリメトリー法(ITC)により，TLR9に対するCpG DNAの結合親和性を求めた。さらに，ゲルろ過法により，各DNAの結合に伴うTLR9の二量体化を調べた。

【結果】
1. 2種類のDNAによるTLR9の活性化機構
　ITCとゲルろ過法により，CpG DNAはTLR9に結合するが二量体化は引き起こさないことが示された(図3，表1)。5’-TCGDNAはそれ単独ではTLR9に対して全く結合しないが，CpG DNA共存下のTLR9に対してはCpG DNAと同時に結合し，TLR9の二量体化を顕著に引き起こすことが明らかになった。興味深いことに，マウスTLR9ではCpG DNA単独でも二量体化が観察された。さらにTLR9の第2のDNA結合部位の配列特異性をITCで調べた結果，CpG DNA共存下のTLR9に対して，5’末端から2番目がシトシンであるDNA(5’-xCx DNA)が結合することが明らかになった(表1)。
　TLR9とCpG DNAと5’-xCx DNAの三者複合体における各DNAの結合様式を明らかにするために、結晶構造解析を行った。その結果，TLR9とCpG DNAと5’-xCx DNAは、2:2:2の複合体を形成していた(図4A)。TLR9の二量体構造およびCpG DNAの結合様式は，以前報告されたCpG DNAとの2:2複合体のものとよく一致していた(文献4)。5’-xCx DNAは新規の結合部位に結合し，5’末端側から1番目のチミンと3番目のグアニンが比較的ゆるく認識されていたのに対し，2番目のシトシンはTLR9の2つのプロトマーから緊密に認識されていた(図4B—E)。5’末端のOH基はTyr345と直接水素結合を形成し，さらにその周囲を周辺残基によって囲まれているため，この部位で追加の塩基やリン酸基を収納することは難しいと考えられる(図4C，表1)。また，2番目のシトシンとTLR9*(以下では，一方のプロトマーを無印で，他方のプロト結合はシトシン塩基特異的であり，この位置でのシトシン選択性を説明すると考えられる(図4D)。これらは5’末端から2番目にシトシンをもつDNAがTLR9に結合するという結合実験の結果と一貫するものであった。

2. マウスTLR9の活性化型二量体の構造解析
　前章のゲルろ過法でのDNA結合実験において，マウスTLR9はウマやウシTLR9と異なり，CpG DNAだけで安定な二量体を形成した。このマウスTLR9の活性化においてみられる種特異性を理解するために，マウスTLR9とCpG DNAと5’-xCx DNAとの三者複合体の結晶構造解析を行った。構造解析の結果，マウスTLR9においてもTLR9とCpG DNAと5’-xCx DNAは2:2:2複合体を形成しており(図5)，TLR9二量体の構造，CpG DNAおよび5’-xCx DNAの結合様式は，前述のウマTLR9の2:2:2複合体と共通していた(文献5)。マウスTLR9とCpG DNAとの結合部位には，前章で述べたようなすべての種で共通したCpGモチーフ部分の認識に加えて，Ile643*の側鎖がCpG DNAとより広い面積で接触するとともに，Pro105，Leu106，Ile643*，Phe668*の間で相補的な形状で疎水性相互作用が形成されていた。一方で，ウマTLR9では，マウスTLR9のLeu106，Ile643*に相当する残基はそれぞれMet106, Thr642*であり，この部位の相互作用の形状相補性はマウスTLR9に比べて好ましくないと考えられる。実際，マウスTLR9のLeu106とIle643を該当するヒトの残基(それぞれMetとThr)に改変した変異体は活性が減弱した。これらの相互作用の違いが，マウスTLR9がCpG DNA単独で二量体化を引き起こし活性化する一因になっている可能性がある。

【結論】
　今回の結果から，TLR9がTLR7およびTLR8と同様に2種類のリガンドにより相乗的に活性化されることが解明された(文献6,7)。CpG DNAだけではTLR9の二量体化と活性化は弱く，ここにさらに5'-xCx DNAが結合することで二量体化と活性化が増強される(図6)。ただし，マウスTLR9は，種特異的な相互作用によって二量体を形成しやすいため，CpG DNA単独でも十分な活性を示す。本研究によって得られた知見は，TLR9の活性化機構を理解するうえで重要な構造的基盤を提供し，TLR9を標的とした薬剤の開発に貢献すると考えられる。

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