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腎代替療法実施患者の感染モニタリングと新規の腎移植免疫抑制薬候補化合物に関する研究

草野 淳一 東京薬科大学

2021.03.19

概要

我が国では、腎代替療法として血液透析、腹膜透析および腎移植が実施されるが、慢性腎臓病(CKD)患者は保存期から透析導入を経過して腎移植に至ることが多い。生命維持のためには継続的な血液透析が必要であるが、長期間にわたる血液透析は患者のQOL に多大な影響を与える。

また、透析患者においては感染症が死亡原因の第 2 位となっており、感染症の発症を予防するための客観的指標が求められている。

一方腎移植においては、急性拒絶反応予防のための免疫抑制療法が必要不可欠である。現在実施されている免疫抑制薬物療法では、その副作用や日和見感染が臨床上大きな問題となっており、新たな免疫抑制薬の開発が期待される。

このように、CKD の腎保存的療法から腎代替療法である透析導入、腎移植に至るまで、患者生命を脅かすリスクは断続的かつ多々存在するのが現状である。

本研究において申請者は、まず第一章で透析患者および各ステージの CKD 患者の感染リスクを把握する目的で、末梢血を用いた ATP 定量を試みた。易感染性の患者を早期に把握できれば、テーラーメード的に感染症の予防対策を施すことで患者の良好な予後に寄与できるものと考えた。

次に第二章では、腎移植患者に使用し得るビタミン K(VK)薬の免疫抑制効果を検討した。本邦で保険適用が認められている医薬品の VK1(Phylloquinone)および VK2(Menaquinone)の免疫抑制効果を、健常者および透析患者の末梢血単核細胞 (PBMC)を用いて評価し、新たな免疫抑制薬としての VK2 のドラッグリポジショニングの可能性について検討を行った。

さらに第三章においては、生薬成分の Tetrandrine(Tet)および本邦で医薬品として用いられているセファランチン®の有効成分にも該当する Tet 類縁体を対象として、 PBMC や各種株化ヒト T 細胞に対する増殖抑制効果を評価し、これらの化合物の新規免疫抑制薬としての可能性を検討した。

第一章 健常者、透析患者および慢性腎不全患者の末梢血 T リンパ球中の ATP 量に関する検討FDA が認可した IMMUKNOW®を用い、透析患者 17 および国内の CKD ガイドラインに準拠して G3a、G3b、G4、G5 の 4 群に分けた CKD 患者それぞれ 17 の末梢 T リンパ球の ATP 値を、健常者 T リンパ球の ATP 値と比較検討した。さらに、各群の血清クレアチニン(S-Cre)値、年齢、および CKD 群では eGFR 値、透析患者群では透析歴と、末梢 T リンパ球の ATP 値との関連を検討した。また、易感染状態を反映する糖尿病の既往の有無と末梢 T リンパ球の ATP 値との関連についても検討を行った。

全ての患者群における末梢 T リンパ球の ATP 値が、健常者群に比べて低値を示した(表 1)。特に G3a(p=0.005)、G3b(p=0.047)、G4 群(p=0.012)では有意に低値を示したが、G5 および透析患者群では有意差はなかった。患者の S-Cre 値、年齢、あるいは透析期間と ATP 値との間に有意な相関はなかった。糖尿病性腎症の有無で患者を 2 群に分けた場合、両群間で ATP 値に有意差はなかった。

CKD の保存期においては、早期の Stage より健常者に比べて易感染状態であることが示され、感染症のコントロールが必要であることが分かった。また、末梢血を用いた T リンパ球の ATP 値モニタリングは、透析患者および CKD 患者の感染リスクを把握し、感染症を未然にコントロールするためのテーラーメード医療の一助となり得ることが示された。

表 1 本章で対象とした被験者の性別、年齢および S-Cre 値

第二章 透析患者および健常者の末梢血単核細胞の T 細胞マイトジェン応答性増殖に対するビタミン K1 および K2 の抑制効果
VK3 と VK5 の免疫抑制効果は既に報告されているが、これら VK は肝毒性のため臨床応用されていない。そこで申請者は、医薬品として用いられている類縁体の VK1および VK2 について、健常者と透析患者の PBMC の T 細胞マイトジェン応答性増殖に対する抑制効果を MTT アッセイ法で検討した。また、活性化 PBMC における 7 種
Th1/Th2/Th17 サイトカイン産生量および制御性T 細胞 (Treg)発現率への影響を、抗体染色/フローサイトメトリー法により検討した。

VK1 は PBMC の T 細胞マイトジェン応答性増殖を抑制しなかったが、VK2 は濃度依存的に PBMC 増殖を抑制した(図 1)。VK1 は、活性化 PBMC からの 7 種の Th1/Th2/Th17 サイトカイン産生量に影響を及ぼさなかった。一方 VK2 は、健常者 PBMC からの IL-4 産生量を増加させた(p=0.04)が、その他のサイトカイン産生量には影響しなかった。VK1 は Treg 率に影響を与えなかったが、VK2 は 100 mM で健常者 PBMC 中の Treg 率を有意に低下させ(p=0.04)、また透析患者 PBMC 中の Treg 率を低濃度から用量依存的に有意に低下させた(p<0.05) (図 2)。

第三章 植物由来アルカロイドの Tetrandrine およびその類縁体の T リンパ球抑制効果に関する検討
Tetrandrine(Tet) および国内医薬品の有効成分であり Tet の類縁体である Isotetrandrine(Iso-Tet)の、T リンパ芽球性白血病 MOLT-4 細胞およびその薬物耐性株である MOLT-4/DNR 細胞の増殖に対する効果を評価した。同様に、健常者および透析患者 PBMC の T 細胞マイトジェン応答性増殖抑制効果を検討した。また、MOLT-4細胞および MOLT-4/DNR 細胞の活性化 NF-κB (p-NF-κB)発現に及ぼす効果を、ウエスタンブロット法で解析した。さらに、Tet と Iso-Tet を含む 7 種の類縁体の構造活性相関を検証した。

Tet および Iso-Tet は、MOLT-4 細胞と MOLT-4/DNR 細胞に対して、細胞増殖抑制効果を示した。どちらの細胞に対しても Iso-Tet の方が強い効果を示した。同様に、健常者および透析患者の PBMC の T 細胞マイトジェン応答性増殖に対し、Iso-Tet は Tet より強い抑制効果を示した。また、透析患者の PBMC は健常者の PBMC と比較して、両化合物の細胞増殖抑制効果に対する感受性が低かった。

Tet と Iso-Tet は共に、MOLT-4 および MOLT-4/DNR 細胞の NF-κB と p-NF-κB 発現を抑制したが、この効果も Iso-Tet の方が強かった (図 3)。Iso-Tet と Tet の化学構造における絶対配置の違いが、T 細胞増殖抑制効果に違いを与えているものと考えられた。これらの結果より、Iso-Tet は新規免疫抑制薬としてより有望な化合物であることが示唆された。

7 種の類縁体を用いた構造活性相関解析の結果、C12 位および C7 位の置換基は T細胞増殖抑制効果に寄与し、特に C12 置換基の寄与が大きいことが示された。また、 monobenzylisoquinoline 構造を持つ化合物と比較しbisbenzylisoquinoline 構造を持つ化合物の方がリード化合物として優れていた。一方、2 つの酸素原子を含む 18 員環マクロ環状構造の存在は T 細胞増殖抑制効果に寄与し、P 糖タンパク質高発現による薬物耐性を回避する過程にも関与していると考えられた。 2 分子の benzylisoquinoline ユニットの一方のエーテル酸素原子の芳香環上の結合位置の違いは、T 細胞増殖抑制効果にさほど寄与しない。以上得られた構造活性相関の知見を活かしてアナログを合成することにより、より有望な新規免疫抑制薬候補化合物を提案できるものと思われた。

【総括】透析患者および CKD 患者の末梢T リンパ球中の ATP 値がこれらの患者における易感染性のバイオマーカーとなり得ること、および本情報に基づいてテーラーメード療法を実施すれば同患者における感染症での死亡率を低減できる可能性を示した。VK2 および Tet の類縁体は、腎移植時に用いられる既存の免疫抑制薬の代替えもしくは併用薬として有望であり、今後更なる検討を重ねることにより臨床への応用が期待できるものと結論した。

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