Identification of DNA-binding sequences of a circadian transcriptional repressor E4BP4 and its functional analysis in glucose homeostasis in mice

概要

地球上に⽣息する多くの⽣物は、24時間周期の環境変化に適応するため、⾃律的な計時システムである概⽇時計を獲得し、維持してきた。概⽇時計は、約24時間周期で発現変動する時計遺伝⼦の転写・翻訳を介したネガティブフィードバック制御から構成されている。リズミックに発現変動する時計タンパク質（転写因⼦）は、時計シスエレメントと呼ばれるDNA上の転写制御配列に結合し、様々な遺伝⼦の発現を時刻依存的に制御している（時計出⼒）。哺乳類は、「出⼒」時刻の異なる３つの時計シスエレメント「E-box」・「D-box」・「RRE」を介して様々な遺伝⼦の発現リズムを⽣み出すことにより、多様な⽣理機能リズムを⽣み出している。時計タンパク質のうち、⼣⽅に発現する転写活性化因⼦DBP、および朝⽅に発現する転写抑制因⼦E4BP4は「D-box」に結合し、それぞれ遺伝⼦発現を活性化および抑制することが知られている。D-box配列の機能解析はinvitroの実験系を中⼼に展開されてきた。具体的には、1990年代初頭にSAAB法により同定されたDBPやE4BP4の結合配列が、時計遺伝⼦のプロモーター領域に保存されていることが判明し、その保存性からD-box配列が定義されてきた（ref.1,2,3）。これに対し、⽣体内において機能するD-box配列（正確にはDBP・E4BP4の結合配列）を網羅的に解析した報告はない。そこで私は、マウス⽣体内において機能しているDBP・E4BP4の結合配列（D-box配列）を解析した。

まず、抗DBP抗体と抗E4BP4抗体を⽤いたChIP-Seq解析を⾏い、DBPとE4BP4が共に結合するDNA領域を同定した。次に、当研究室の先⾏研究により開発されたモチーフ探索ツールMOCCS（ref.4）を改良し、マウス肝臓において機能するD-box配列を探索した。MOCCSは、タンパク結合部位近傍に頻出する塩基配列を抽出する⼿法であるが、出現回数の低い塩基配列が偽陽性として検出されるという問題点があった。そこで私は、乱数を⽤いたシミュレーションを⾏い、出現回数に応じたスコアの分散を決定し、これに対して有意に⼤きいスコアを持つ配列をリストアップした。この改良MOCCS法を⽤いることにより、invivoで実際に機能しているD-box配列群の同定に成功した（図1）。

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