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エゾムラサキツツジ由来メロテルペノイド daurichromenic acid の生合成研究

飯島 未宇 富山大学

2020.03.24

概要

エゾムラサキツツジ(Rhododendron dauricum)はツツジ科に属する落葉低木で、北海道やアジア東北部に分布している。本植物は早春に花を咲かせるツツジとして人気が高く、北海道では多くの市町村で自治体の花に指定されている。また中国では乾燥した本植物の葉を「満山江(Man-shan-hong)」と称し、慢性気管支炎や気管支喘息の治療に用いてきた歴史がある。さらに近年の研究から、本植物が興味深い薬理活性を示す化合物を含有することが明らかとなった。例えば、本植物の葉部に含まれるダウリクロメン酸(daurichromenic acid、以下 DCA)は、メロテルペノイドと称されるポリケタイドとセスキテルペンの部分構造を併せ持つハイブリッド型化合物の一種であり(図 1)抗菌、抗カビ、抗炎症作用に加えて、強力な抗 HIV 活性(H9 細胞感染時 EC50 15 nM)を示すことが証明され、医薬資源として注目を集めてきた。

このため、本化合物の有機合成研究が盛んに行われ、2010 年にスイスの Woggon らが立体選択的な合成に初めて成功した。しかしながら本合成法は高価な出発物質から 9 ステップを要するものであり、実用性には乏しいと考えられた。また本植物は DCA と類似した化合物を多数含有するため、これを植物から精製することも容易ではない。即ち、効率的な調製法が確立していないことが DCAの医薬品応用に向けた研究を妨げている現状がある。以上の背景から、合成生物学的手法を用いた DCA の生物生産は興味深い課題と考えられるが、これを検討するためには本化合物の生合成メカニズムを明確にし、生合成酵素の遺伝子をクローニングする必要がある。そこで本研究では生合成経路の最終ステップを担う DCA 生合成酵素の単離およびその機能解析を行うことで、DCA 生合成メカニズムの解明を目的とした。

第一章 植物体からの酵素活性の検出および性質 1)
生合成研究を行うにあたり、初めに植物におけるメロテルペノイドの組織分布について検討した。即ち若葉、成熟葉、若枝、花および根からメタノールエキスを調製し、HPLC により分析した。そ の結果、DCA および grifolic acid などのメロテルペノイドは本植物の若葉に最も多く含まれている ことが判明した。

次に若葉より調製した細胞抽出液について、可溶性画分と膜画分とに分画した粗酵素を調製し、アッセイ行った。その結果、可溶性画分に grifolic acid のfarnesyl 基を酸化閉環することにより DCA を生成する酵素の活性を検出し、本酵素を DCA synthase と命名した。一方、膜画分を用いた反応で は酵素活性は検出されなかったことから、DCA synthase は可溶性酵素であることが明らかとなった。

次いで酵素反応の立体選択性を調べるために、酵素反応により生成した DCA をキラル HPLC により分析した。この結果、DCA synthase は (+)-DCA と(-)-DCA を約 95 : 5 のエナンチオ選択比(~90 % ee)で合成しており、天然物として報告された (+) 体を優先的に合成することを確認した。さらに各種 pH のバッファーを用いて酵素反応の至適 pH を検討したところ、本酵素は pH 6 付近で最大活性を示すことを確認した。天然物の farnesyl 基を閉環する酵素として、farnesyl pyrophosphate の閉環を触媒する一連の酵素(sesquiterpene cyclase)が知られており、これらの酵素による閉環反応はいずれも Mg2+あるいは Mn2+を要求することが報告されている。そこで DCA synthase に対する Mg2+およびMn2+の影響を検討したが、これら金属イオンは本酵素の活性に対して顕著な影響は与えないことが判明した。興味深いことに、以上のような酵素反応の諸性質は geranyl 基の酸化閉環反応を触媒するカンナビノイド合成酵素について報告されたものと良く類似していた。DCA synthase はメロテルペノイドの farnesyl 基を酸化閉環する初めての植物酵素として興味深く、本酵素の遺伝子をクローン化し、構造機能に関しさらに詳細な知見を得る必要があると考えた。

第二章 DCA synthase の cDNA クローニングと構造機能解析 2)
DCA synthase が触媒する酵素反応の諸性質は大麻のカンナビノイド合成酵素と類似していた。カンナビノイド合成酵素についてはこれまでにtetrahydrocannabinolic acid synthase およびcannabidiolic acid synthase の遺伝子がクローン化され、その全一次構造が解明されており、それらはいずれも FADと結合した oxidase であることが確認されている。そこで私はDCA synthase がFAD oxidase である可能性を考え、エゾムラサキツツジ若葉のトランスクリプトームデータから、本植物で発現している FAD oxidase をセレクトし、次いで得られた cDNA を酵母 Pichia pastoris に導入し、組換え酵素を発現して酵素活性を測定することにより、DCA synthase をコードする遺伝子を確定した。DCA synthase は 533 アミノ酸からなり、カンナビノイド合成酵素に加えて、イソキノリンアルカロイド生合成経路で機能する berberin bridge enzyme やビンカアルカロイド生合成経路のprecondylocarpine acetate synthase とアミノ酸レベルで約 40%が一致しており、高いホモロジーを有することを確認した。また酵母で発現した組換え酵素は細胞外に分泌されたが、PSORT 解析により本酵素の N 末端には 24 アミノ酸のシグナルペプチドの存在が示唆された。

次いで酵母の培養上清より、hydroxylapatite およびCM-Toyopearl クロマトグラフィーにより組換え酵素を精製した。得られた組換え酵素の N 末端アミノ酸配列分析の結果、分泌シグナルが適切に切断され成熟タンパク質として培地中に分泌されていることを確認した。また精製酵素は 380 nmおよび 450 nm に極大吸収を示したことから、FAD と結合していることが示唆された。さらに DCA synthase の分子モデリングから、既知 FAD oxidase において FAD との共有結合形成に関与する Hisおよび Cys が本酵素においても適切な位置に保存されていることを確認した。以上のことから、 DCA synthase は大麻のカンナビノイド合成酵素に類似したFAD oxidase であると考えられた。植物のFAD oxidase は多様な代謝酵素を含んでいるが、メロテルペノイドの生合成に関与するものは稀であり、またDCA synthase はfarnesyl 基を酸化閉環する初めてのFAD oxidase である。

次いで組換え酵素を用いた生化学的解析の結果、本酵素は FAD および分子状酸素に依存したメ カニズムで酸化閉環反応を触媒することを証明し(図 2)、また基質特異性に関しては farnesyl 基(C15)を有する grifolic acid に最も高い活性を示す一方、イソプレノイド部分が geranyl 基(C10)および geranylgeranyl 基(C20)の基質アナログに対しても弱いながら活性を示し、各々に対応する DCA ア ナログを合成することを確認した。本酵素が in vitro で生成した DCA アナログがエゾムラサキツツ ジに存在するか確認するため、若葉エキスを LC-ESI-MS で詳細に分析した結果、これら DCA アナ ログおよびその前駆体を本植物の微量成分として同定し、本植物がパラレルな経路により異なるイ ソプレノイド鎖長のメロテルペノイドを生産することを明らかにした。なおイソプレノイド部分が diterpene の diterpenodaurichromenic acid は過去に報告のない新規化合物であった。このように複数のプレニル基質を酸化閉環するFAD oxidase は DCA synthase が初めてである(表 1)。

第三章 DCA 生合成の組織特異性 2), 3)
エゾムラサキツツジは鱗片という特殊な表皮組織を有する有鱗片シャクナゲの一種であり、本植物の茎葉には無数の鱗片が観察できる。蛍光顕微鏡を用いて本植物若葉を観察したところ、鱗片が明確な自家蛍光を発することを見出し(図 3A)、鱗片に蛍光性の代謝産物が蓄積していることを確認した。さらに鱗片を単離し、メタノールエキスのTLC 分析を行った結果、蛍光成分は DCA であることを確認した。

次いで単離した鱗片について共焦点顕微鏡で観察した結果、図 3B に示すように DCA に基づく蛍光は鱗片のアポプラストに局在していることを確認した。さらにタバコ培養細胞での GFP 融合タンパク質の発現解析により、DCA synthase は植物細胞からも分泌されることを証明した。以上より DCA は鱗片の細胞外で特異的に生産蓄積されると考えられる。DCA は抗菌、抗カビ活性を有することから、鱗片のアポプラストという植物の最外層で生体防御に機能すると考えられる。大麻のカンナビノイドは分泌腺の頭部や油体といった非細胞性のスペースに局在することが知られているが、これと構造的に類似した DCA もカンナビノイドと同様細胞外に局在するという知見は興味深い。

一方で、エゾムラサキツツジの培養細胞を DCA およびgrifolic acid で処理することにより、本培養細胞に細胞死を誘導することを明らかとした(図 4)。即ち DCA は植物に対しても有毒であると考えられる。以上の結果から、本植物は自己毒性の回避と化学防御を両立するため鱗片の細胞外でメロテルペノイドを生産、蓄積する生合成スタイルを確立したと考えられる。

結論
本研究ではエゾムラサキツツジよりDCA synthase と称する新規なFAD oxidase を見出し、その構造機能および生化学的性質についての知見を得ることに成功した。さらに本植物における DCA 生合成の組織特異性についても明らかにした。これらの成果は、植物酸化閉環酵素の生化学および植物生理学、代謝生化学の発展に大きく寄与する。

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