生体内分解性素材としてのマグネシウム埋植時の空隙形成抑制におけるBrushite皮膜処理の有用性に関する研究
概要
博士論文
生体内分解性素材としてのマグネシウム埋植時の
空隙形成抑制における Brushite 皮膜処理の有用性に関する研究
東北大学大学院医学系研究科医科学専攻
外科病態学講座
形成外科学分野
相
1
澤
貴
之
目次
頁
要約
・・・・・・・・3
研究背景
・・・・・・・・6
研究目的
・・・・・・・・11
研究方法
・・・・・・・・12
研究結果
・・・・・・・・20
考察
・・・・・・・・26
結論
・・・・・・・・34
謝辞
・・・・・・・・35
文献
・・・・・・・・37
図説
・・・・・・・・44
表
・・・・・・・・50
図
・・・・・・・・57
2
Ⅰ
要約
【背景】高強度でありながら、生体内で分解消失し、さらに骨形成を促進する理想的
な骨接合材の素材として Mg が注目されている。しかし Mg や多くの Mg 合金は生体
内環境で短期間のうちに腐食が始まり、腐食生成物や水素ガスを発生するとともにデ
バイス強度の低下による破折も報告されている。さらに腐食過程で発生した水素は速
やかに拡散するが、窒素、酸素、二酸化炭素を主とする空隙を周辺組織内に形成し、
骨壊死を引き起こす場合や骨癒合を遅らせる場合もある。そこで生体内で骨癒合が得
られるまでの十分な強度の維持と、急激な水素ガス発生を抑制するために様々な表面
処理が検討されている。その中で私は生体適合性、耐食性および溶解性の観点から、
骨の成分でもあるリン酸カルシウムからなる Brushite 皮膜処理を施すことにより空
隙形成の抑制と、骨癒合を得た後の速やかな腐食分解による消失を目指している。腐
食分解時の空隙形成を抑制することは理想的な骨接合材への大きな課題の解決につ
ながるものである。
【研究目的】未処理の純 Mg 試料と Brushite 皮膜処理を施した純 Mg 試料を in vitro
実験と in vivo 実験の両面から定量的に分析し、Brushite 皮膜処理の空隙形成抑制効
果を検証する。
【方法】試料は 99.9 質量%以上の純 Mg 試料(以下、未処理群)と、それに Brushite
皮膜処理を施したもの(以下、皮膜処理群)を用いた。in vitro 実験では細胞培養培
地をゲル化して疑似生体組織としたものに 5%CO2 下で両群の試料を浸漬しつつ、X
3
線 CT で観察した。in vivo 実験ではラットの背部皮下へ同試料を埋植し、埋植直後か
ら高頻度に CT で観察した。それぞれの実験において埋植前後の試料重量、埋植中の
空隙体積、試料表面元素のエネルギー分散型 X 線分析(以下、EDX)を行い、さらに
埋植実験では試料表面の腐食生成物を含む不溶性塩の誘導結合プラズマ質量分析(以
下、ICP-MS)による定量分析と埋植試料周囲組織の病理組織学的解析を行った。
【結果】in vitro 実験・in vivo 実験ともに未処理群に比して皮膜処理群で各測定点に
おける空隙体積は有意に小さかった。in vitro 実験の空隙体積は時間経過とともに増
大したが、in vivo 実験の空隙体積は埋植直後のピークの後に減少した。試料表面の
EDX による分析では未処理群において、in vitro 実験・in vivo 実験ともに実験後に
は表面に Ca と P が検出された。in vivo 実験後の試料表面における不溶性塩の ICPMS による定量分析では、未処理群に比して皮膜処理群で Mg・Ca・P は有意に少な
かった。病理組織像解析では両群の 3 日目・7 日目とも軽度の炎症を示唆する肥満細
胞の出現と血管新生を認めた、両群ともに 7 日目は 3 日目よりも肥満細胞数・血管数
当たりの肥満細胞数の有意な減少を認めた。血管数の平均値は両群ともに 3 日目と比
して 7 日目で増加したが有意差はなかった。
【考察】Brushite 皮膜処理は空隙形成を有意に抑制することが示された。in vitro 実
験と in vivo 実験の空隙体積の挙動の違いは、生体内では血管透過性亢進と血管新生
を伴う炎症反応により局所血流の上昇と物質の移動速度の増加が起こったため、拡散
速度が上昇しガス発生量を上回ったと考えられる。7 日間埋植後の試料表面の元素分
4
析では、未処理群に比して皮膜処理群で Ca・P は少なかったが、その理由はこの測
定点までに耐食性被膜処理により Mg の腐食反応を抑えたことにより、腐食反応に伴
う Ca・P の析出量は抑えられ、さらに Brushite 皮膜の溶出もあるためと考える。
【結論】Brushite 皮膜処理は生体内埋植後少なくとも 1 週間において Mg 分解時の
空隙形成を有意に抑制することがわかった。本研究は Mg 素材の急激な腐食分解に伴
う空隙形成に関する課題を乗り越えるための重要なデータであり、理想的な骨接合材
としての Mg の可能性を支持するものである。
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Ⅱ
研究背景
骨折治療に用いられる骨接合材(プレート・スクリューなど)には、チタン(以下、
Ti)およびその合金と、ポリ L 乳酸(以下、PLLA)などの生体内分解性ポリマーな
どが実用化されている。Ti は強度・耐食性・生体適合性に優れるが[1, 2]、骨折治癒
後にも異物として残存する。留置したままの骨固定材は骨への荷重を遮断し骨吸収や
再骨折の原因にもなるなど悪影響を及ぼす可能性があるため、除去手術を要すること
もある[3, 4]。また Ti は弾性率が皮質骨より高く、生理的な荷重伝達を遮断すること
により骨の萎縮や吸収の原因ともなり得る[5]。一方、PLLA は除去手術を回避できる
が、機械的強度が低いため強い負荷がかかる部位では使用できない[6]。また、PLLA
は生体内での分解に数年と比較的長期間を要することも多い[7]。そこで強度が高くか
つ PLLA より速やかな生体内分解性を示すマグネシウム(以下、Mg)合金が新たな
骨接合材として注目されている。Mg 及び Mg 合金は骨と同等のヤング率(40~45GPa)
を示し、体液中の水と反応して容易に腐食する。腐食に伴い生成する Mg 塩・カルシ
ウム(Ca)塩が骨形成を促進するため、PLLA よりも臨床応用に適していると考えら
れる[8-14]。
すでに世界中で Mg 合金の生体内分解性医療機器としての開発研究がなされてお
り、私の所属する研究室では、三浦らが Ti と同様の生体適合性を[15]、佐藤らが埋植
初期に放出される Mg²⁺イオンの生体安全性を示す報告をしてきた[16]。しかし、そ
れらの研究でも埋植時の空隙形成を観察しており、Mg 合金の生体内腐食挙動の解明
6
と制御という課題は未解決である。Mg 合金による骨折治療の成否には、体内におけ
る材料の腐食速度がとくに大きな影響を及ぼす[17]。Mg 合金は腐食に伴い水素ガス
(H2)が発生し、発生速度と拡散速度の差分が空隙となる。空隙内のガス成分につい
ては、発生した水素ガスは発生後速やかに拡散し、空隙内には窒素(N2)、酸素(O2)、
および二酸化炭素(CO2)が主に検出され、水素はわずかしか検出されないことが報
告されている。[18]。埋植した Mg デバイス周囲が血流や体液循環の乏しい部位の場
合は気体の拡散能は低く、さらに空隙が形成されやすい[19]。実際に Mg 合金製スク
リューを使用した臨床例では、組織中に空隙の形成が観察されている。Mg 合金製ス
クリューを用いた 39 例の外反母趾治療症例について Plaass らは、6 週間の経過観察
中 38 例においてスクリュー周囲骨組織中に骨壊死を伴う空隙形成を認め、スクリュ
ーの早期崩壊 7 例、破損も 1 例あったと報告している[20]。また、Kim らは Mg 合金
製スクリューによる中足骨骨折治療例において、軟組織及び骨組織中の空隙体積は埋
植 1 週間後に最も大きく、以後減少することを報告した[21]。さらに Wichelhaus ら
は舟状骨を含む手関節の関節固定術に Mg 合金製スクリューを用いた際に、スクリュ
ー周囲の溶骨性変化によるスクリューの不安定性を認め、再手術を要したと報告した
[22]。このように空隙形成は骨を含む損傷組織の治癒に悪影響を及ぼす。それゆえ、
Mg 合金試料の生体内での分解挙動(腐食速度・強度の変化・ガス発生・腐食生成物・
周囲組織への影響など)を分析し、それらの最適化を図る必要がある。
これまでに Mg 合金の組成・表面処理による腐食の制御が試みられ、生体内におけ
7
る腐食過程が研究されてきた[17, 23, 24]。現在、腐食速度を制御する方法としては、
合金の組成を工夫する他に表面処理による方法があり、特に耐食性や生体適合性が重
要視され多くの報告がある[25-28]。その中でも生体用金属材料の骨適合性被膜として
既に使用されているリン酸カルシウム(以下、Ca-P)被膜に関する検討が盛んである。
Ca-P は歯と骨を構成する成分の一つであり、それらの中ではハイドロキシアパタ
イト(以下、HA)として存在する。HA の化学式は𝐶𝐶𝐶𝐶10 (𝑃𝑃𝑂𝑂4 )6 (𝑂𝑂𝑂𝑂)2 と表され、Ca/P
は 1.67 である。生体内における HA 形成の前駆物質にはリン酸八カルシウム(化学
式𝐶𝐶𝐶𝐶8 𝐻𝐻2 (𝑃𝑃𝑂𝑂4 )6 ∙ 5𝐻𝐻2 𝑂𝑂;Ca/P 比 1.33)や、Brushite(化学式𝐶𝐶𝐶𝐶(𝐻𝐻𝐻𝐻𝑂𝑂4 )2𝐻𝐻2 𝑂𝑂;Ca/P 比
1.0)などが存在し、細胞障害性はなく生体親和性が高いことからリン酸八カルシウム
は人工骨に、Brushite は骨セメントに使用されており[29]、またβ-リン酸三カルシ
ウム(β-TCP;化学式𝛽𝛽 − 𝐶𝐶𝐶𝐶3 (𝑃𝑃𝑂𝑂4 )2 ;Ca/P 比 1.50)は HA との混合比率で溶解速
度を調節でき、人工骨に使用されている[29]。このように Ca-P は Ca/P により様々な
結晶構造を有し、様々な用途において実用化されている。それぞれ溶解性も異なり、
一般に Ca/P が小さいほど溶解性が高い[29, 30]とされる。
Brushite は HA の前駆物質であり結晶構造の類似点が多く、さらに溶解性が高い。
このような特徴のため、私の所属する研究室では埋植初期に比較的短期間の腐食分解
抑制による空隙形成阻害効果が期待できると考え、Brushite による皮膜処理に注目
して研究を行ってきた[31]。
様々な合金や様々な表面処理を施した金属での腐食挙動や骨形成誘導能が研究さ
8
れており、骨形成を得ながらも空隙形成が抑制されることで為害作用がなく消失する
素材が理想と考えられている。そのために空隙形成挙動と骨への為害作用の関連を詳
細に観察し、空隙形成の許容量や最適な抑制方法を求めてきた。これまでは候補試料
を実験動物に埋植して一定期間の後の CT による観察と病理組織的な評価を主に行っ
てきた。しかしこの方法では試料が腐食分解される際の空隙が発生する場所、局所の
空隙発生量、及び埋植後ごく短時間を含む時間経過に伴う挙動を詳しくとらえること
ができない。さらには実験動物の体内環境の変化や個体差もあるために試料ごとの細
やかな比較も困難であるという問題もあり[32]、実験動物を多く要することにも倫理
的な問題をはらんでいる。
生体内環境を模しつつ詳細に比較できる in vitro 実験も多く報告されている。浸漬
実験では生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、平衡塩類溶液、細胞培養培地、及び蛋
白質成分を加えた細胞培養培地などが浸漬液として用いられており、無機イオンの存
在が腐食速度を上昇させ、蛋白質成分は腐食速度を低下させるなど一定の知見が報告
された[33]。また、2016 年 Myrissa らは純 Mg と 2 種類の 2 元合金(Mg-Gd、MgAg)の腐食速度を、細胞培養培地を用いた in vitro 実験・ラットを用いた in vivo 実
験で検証し、材料の組成、浸漬媒体または局所環境による腐食速度の違いを認めると
ともに、in vivo での腐食速度がある程度 in vitro でも反映されることを報告した[34]。
しかしながらこれまでの in vitro 実験に共通する限界として、使用されてきた浸漬
液が液体であるため、発生した空隙は試料近傍にとどまらず気泡として離れてしまう
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問題があった。そのため発生部位ごとの発生量は観測できず、また空隙が試料に接し
ていることによる試料に対する影響も観察することはできない。つまり、空隙が発生
しやすい場所、空隙がたまる場所、及び空隙の形成に影響され優先的に腐食分解され
る場所などを把握することができないことになる。これは製品をデザインする際に大
きなデメリットとなる。
こ れ ま で の in vitro 実 験 の 問 題 を 解 決 す る た め に 、 私 の 共 同 研 究 者 で あ る
Yamamoto らはゲル状の疑似生体組織による浸漬試験法を開発し、2022 年に報告し
た[35]。本疑似生体組織による浸漬試験法は、報告されている in vitro 実験[33, 36]よ
りも生体内環境に近く、均一な条件下で生体内分解動態を詳細に観察・分析する方法
である。つまり、ゲル状の疑似生体組織に浸漬することにより、発生する空隙は周囲
の水分に溶解して拡散しない限り生体内同様に近傍にとどまり、空隙の発生部位・発
生部位ごとの空隙体積・それにより試料の腐食分解挙動への影響を観察することが可
能となる。さらに、均一な条件での比較により候補材料の特性のわずかな差も検出可
能であり、非常に有効な試験方法である。
本研究では、純 Mg 材と Brushite 皮膜処理を施した Mg 材に対して、Yamamoto
らが開発した疑似生体組織への浸漬実験とラットへの埋植実験を行って、Mg の分解・
空隙形成・組織反応を検討することにより、Brushite 皮膜処理の有用性を検証するも
のである。
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Ⅲ
研究目的
本研究の目的は、純 Mg 材と Brushite 皮膜処理を施した Mg 材に対して疑似生体
組織への浸漬実験とラットへの埋植実験を行うことにより、Mg の分解挙動・空隙形
成・組織反応を検討し、Brushite 皮膜処理の空隙形成抑制における有用性を可視化・
定量化することである。
in vitro 実験(疑似生体組織への浸漬実験)では、以下の項目を明らかにする
・ Mg 材の重量減少量への影響
・ 空隙形成抑制効果
・試料表面の不溶性塩・腐食生成物への影響
in vivo 実験(ラットへの埋植実験)では、以下の項目を明らかにする
・ Mg 材の重量減少量への影響
・ 空隙形成抑制効果
・ 試料表面の不溶性塩・腐食生成物への影響
・ Mg 材を埋植した周囲組織への影響
両実験から Brushite 皮膜処理が、空隙形成抑制に有用であることを検証する
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Ⅳ
研究方法
1. 試験試料
本研究では市販の純 Mg ワイヤー(99.9 質量%、φ1.2 mm、株式会社マクルウ、
静岡)を 7 mm 程度に切断後、SiC 紙にて JIS#1200 まで研磨し、長さ 6 mm の試料
を作製した。公称組成を表 1 に質量%で示す。表面の自然酸化被膜をナイタール (5%
硝酸エタノール溶液;20℃) にて浸漬後、超純水にて洗浄、真空乾燥した。これを未
処理群とする。また、Mg 試料を Brushite 皮膜処理(日本パーカライジング株式会
社、東京)したものを皮膜処理群とする。
実験に先立ち各試料の試験前重量(𝑊𝑊0 )を測定、エチレンオキサイドガス(EOG)
滅菌し、真空で保存した。使用した Mg 試料写真を図 1 に示す。
2. in vitro 実験
(1) 疑似生体組織への浸漬[35]
模擬体液として 10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したイーグル最小必須培地(EMEM「ニッスイ」、日水製薬株式会社、東京)を用いた。E-MEM の主要な化学成分
をヒト血漿の化学成分[37]と比較して表 2 に示す。生体組織を模するために、増粘剤
(ゲランガム、和光純薬株式会社、大阪)を模擬体液に添加した。皮下組織のガス拡
散速度を模したゲルとなる濃度として最終濃度 0.4%(w / v)になるように秤量した
ゲランガムを超純水に 90℃にて溶解後、E-MEM を添加、オートクレーブ滅菌した。
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その後、溶液を 55℃に維持しながら 3%L-グルタミン酸、7.5%NaHCO3、FBS を、
それぞれ必要量を無菌的に添加し、疑似生体組織溶液とした。
浸漬手順の概略図を図 2 に示す。調製した疑似生体組織溶液 5 mL を滅菌ポリスチ
レン容器に注ぎ、室温で 3 分間置いて固化させた。次に、試料上面が疑似生体組織の
上面に一致するように垂直に埋めた。さらに、疑似生体組織溶液 3 mL を注ぎ、試料
を完全に疑似生体組織に浸漬した。作業は細菌汚染を避けるため、全てクリーンベン
チ内で無菌的に行った。容器の蓋はガス交換のためにゆるく締め、CO2 インキュベー
ター(37 ℃、5%CO2)に静置した。
疑似生体組織溶液への浸透実験は、未処理群(n=3)、皮膜処理群(n=3)で行った。
(2) 空隙体積測定
試料を埋植した疑似生体組織の観察にはマイクロフォーカス X 線 CT システム
(SMX-90CT、島津製作所、京都、以下 µCT と記載)を用いた。埋植後 1 週間まで
の環境を再現するため、浸漬固化作業の終了時(浸漬後 2 時間、以下 0 日目とする)、
および 1・3・5・7 日に測定した。浸漬後 1 日は in vivo において埋植後の炎症が最
も強い時期と対応し、その後は均等に 3 測定点を設定した。試料の初期表面積𝑆𝑆0 は、
0 日目の µCT 画像から、画像解析ソフトウェア(VG Studio Max 3.0、Volume
Graphics Co.,Ltd、愛知)を使用して算出した。疑似生体組織中に形成された空隙の
体積は、画像解析ソフトウェアで計測後、𝑆𝑆0 で除し、単位表面積あたりの空隙体積
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𝑉𝑉𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 [mm³/mm²]とした。
(3) 重量測定
7 日間の浸漬終了後、試料を疑似生体組織から回収し、真空乾燥した。試料表面に
形成された腐食生成物・不溶性塩をクロム酸混液で除去し、超純水で洗浄後再度真空
乾燥した。クロム酸混液の組成は表 3 に示す。
各試料の試験後重量(𝑊𝑊𝑟𝑟 )を測定後、単位表面積あたりの腐食減量𝑊𝑊𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙 [𝑔𝑔⁄𝑚𝑚𝑚𝑚2 ]を
次の式を用いて算出した。
𝑊𝑊𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙 =
𝑊𝑊0 −𝑊𝑊𝑟𝑟
(1.1)
𝑆𝑆0
また、浸漬期間中に腐食によって発生する総気体量を計算するため、発生した H2
を理想気体と想定し、単位表面積あたりの総気体量𝑉𝑉𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡 [𝑚𝑚𝑚𝑚3 ⁄𝑚𝑚𝑚𝑚2 ]を次の式を用
いて算出した。
𝑉𝑉𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡 =
104 W𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙
𝑊𝑊𝑚𝑚
p
∙RT
×10−2
(1.2)
ここで、𝑊𝑊𝑚𝑚 、R、T、および p は、それぞれ Mg の原子量(24.3 [g/ mol])、気体定
数(0.0821 [Latm/ Kmol])、絶対温度(310 [K])
、および大気圧である。p を 1[atm]
と仮定すると、式 2 は次の式で表せる。
𝑉𝑉𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡 = 1.047 × 106 𝑊𝑊𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙𝑙
(1.3)
𝑉𝑉𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐𝑐 と𝑉𝑉𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡𝑡 の比較により、発生する気体のうち、空隙に留まった割合が推定可能
である。
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(4) 試料表面の元素分析
各群代表的な 1 試料のみ、疑似生体組織への浸漬後に、クロム酸混液処理の前後で
走査型電子顕微鏡(SEM;JSM-6390LA、日本電子(株)、東京)によるエネルギー
分散型 X 線分析(EDX)を行った。EDX では dwell time:10 msec、sweep 回数:
50time、spot size:55 µm にて線分析を行った。
3. in vivo 実験
(1) ラットへの埋植
動物実験プロトコルは、国立大学法人東北大学の動物実験等に関する規定に従い、
実験計画の承認を得て行った(承認番号:2020 医動-03,2022 医動-009-01)。実験動
物の管理は Guide for the Care and Use of Laboratory Animals 8th ed (National
Research Council, revised in 2010)に従い行われた。まず試料埋植後、1・3・5・7 日
に実験動物用 X 線 CT(以下、aCT; Latheta LCT-200、日立アロカ、東京)にて試
料周囲の空隙を観察し、その後試料を摘出し試料表面の元素分析を行った(以降、CT・
元素分析実験)。測定点はⅣ.2.(2)の通りに設定した。次に試料埋植後 3 日目と 7 日目
に安楽死させ、試料周囲組織の病理組織像を分析した(以降、病理学的解析実験)。
上記結果を踏まえて、埋植直後の空隙形成を詳細に観察する必要が生じたため、埋
植後 0.5・1・2・4・6・12・24・36・48・60・72 時間経過後に CT・元素分析実験と
同様の手技で aCT で観察する実験 (3 日間実験) を追加した。本実験での測定点は、
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埋植後可及的速やかに CT 撮影した 0.5 時間を初回とし、間隔を徐々に伸ばし、その
後炎症の最も強い埋植後 24 時間時点の前後から 12 時間ごとに設定し、空隙の大き
さが安定していた 72 時間(3 日目)までとした。
ラットは Wister 種を 11 週齢で購入し、通常の飼料・水道水を常時与えて一週間の
順化を行った。12 週齢となった成体ラット (260~282 g、平均 270.2 g) 24 匹を未処
理群、皮膜処理群に 12 匹ずつ分け、CT・元素分析実験(3 日間観察実験、7 日間観
察実験)、及び病理学的解析実験(3 日目観察実験、7 日目観察実験)の 4 つの実験に
それぞれ各群 3 匹計 6 匹ずつ無作為に割り付けて埋植実験を行った。本サンプルサイ
ズは統計処理による比較ができる最低限として設定したものであり、統計学的に必要
なサンプルサイズとして算出されたものではない。
術後のラットは術前と同様に環境管理されたケージの中で飼育した。術後は創の観
察、および健康状態の観察を行った。
(2) 埋植手術手技
全身麻酔は、5.0%イソフルラン(動物用イソフルラン、Intervet、東京)の吸入に
より導入し、手術の間イソフルラン濃度 2.5~3.0%にて維持した。続いてエピネフリ
ン添加 1%リドカイン注射液(0.01 mg / kg 未満;キシロカイン®注射 1%エピネフリ
ン、アストラゼネカ、大阪)を手術部位に皮下注射し局所麻酔を施行した。ラットの
背部皮下に未処理試料または皮膜処理試料を埋植した。皮膚切開は背部の正中から 15
16
mm 外側・大腿前縁から 15 mm 頭側の位置に 2 mm の切開とし、内径 18 ゲージ
(1.25 mm)の留置針を切開部から約 2 cm 頭側へ挿入し、内筒を抜いて外筒のみを
留置した。留置した外筒内を通して試験試料を留置予定部位に押し出して、試験試料
を埋植した。 ...