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The lectin-like domain of thrombomodulin is a drug candidate for both prophylaxis and treatment of liver ischemia and reperfusion injury in mice

Kawasoe, Junya 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23072

2021.03.23

概要

背景
　虚血（ischemia）状態にある組織に血液が再灌流（reperfusion）した際に惹起される組織障害のことを虚血再灌流障害（Ischemia and Reperfusion Injury：IRI）という。播種性血管内凝固症候群（DIC）の治療薬として臨床で使用されているリコモジュリンⓇには抗炎症作用があり、肝IRI の抑制に有効である事が報告されているが、その抗トロンビン活性により周術期における投与には出血のリスクを伴う。今回、リコモジュリンⓇの抗トロンビン活性をもたない分画であるレクチン様ドメインのみのリコンビナント製剤（rTMD1）を用いて肝IRI への効果を検証した。

方法
　8-10 週齢の野生型（WT）C57BL/6 マウスおよびToll-like receptor 4（TLR-4）ノックアウト（KO）マウスを用いて、肝IRI におけるrTMD1 の効果について検証した。60 分間の 70%肝部分虚血と引き続く再灌流 6 時間後での肝障害の程度、肝細胞からの Highmobility group box 1（HMGB-1）の放出、肝臓内への炎症細胞の浸潤、炎症性サイトカインの発現などについて、Ischemia and Reperfusion（IR）刺激のみの群とIR 刺激および rTMD1 投与する群において比較検討した。rTMD1 の投与は、虚血操作 30 分前、再灌流と同時、再灌流1 時間後の3 点で検証を行った。また、in vitro 培養にて、マウス腹腔マクロファージを HMGB-1 で刺激し産生される TNF-αの発現に対する rTMD1 の効果を検証した。

結果
　虚血操作 30 分前に rTMD1 を投与した群においては、IR 刺激による血清肝酵素 ALT値の上昇および肝組織におけるネクローシスが有意に抑制された。血清HMGB-1 値は再灌流1 時間後に著しく上昇し、その後漸減したが、rTMD1 投与群では再灌流6 時間後において rTMD1 非投与群に比して有意な低下がみられた。また、rTMD1 投与群においては肝臓への好中球・マクロファージの浸潤数の減少、炎症性サイトカイン（IL-6、TNFα、IL-1β）およびケモカイン（CXCL-2）の発現低下、TUNEL 染色における陽性細胞数の有意な減少がみられた。rTMD1 の投与タイミングの検証においては、虚血30 分前、再灌流と同時、再灌流 1 時間後のいずれにおいても、rTMD1 投与により血清 ALT 値、肝組織におけるネクローシスが共に有意に改善した。in vitro 培養においては、WT マウス由来腹腔マクロファージに対する HMGB-1 刺激は培養液中のTNF-α濃度を著しく上昇させたが、rTMD1 の添加はこれを容量依存性に抑制した。また、HMGB-1 刺激30 分前、刺激と同時、刺激30分後のrTMD1の添加では、いずれのタイミングにおいてもTNFαの産生は有意に低下した。一方、TLR-4 KO マウスでは、IR 刺激による肝障害および腹腔マクロファージのHMGB-1刺激によるTNF-α産生のいずれもWTマウスに比し強く軽減されたが、rTMD1 による肝IRI の抑制効果は見られなかった。

考察
　通常HMGB-1 は核内転写因子として存在しているが、IR に起因するサイトカイン刺激や肝細胞の壊死に伴って肝細胞外へ放出され、TLR-4 に結合して炎症のメディエーターとして働く。TLR-4 KO マウスを用いた比較検討から、rTMD1 は受容体 TLR-4 とHMGB-1 の結合を阻止することにより肝 IRI の発症および炎症を抑制することが考えられた。また、rTMD1 は虚血 30 分前、再灌流と同時、再灌流 1 時間後のいずれの投与タイミングにおいてもIR 刺激による肝障害を抑制した。さらに、再灌流1 時間後にはマウス血清中HMGB-1 値の著しい上昇を認めており、このタイミングでrTMD1 を投与したことが、再灌流後の投与であってもHMGB-1 による炎症および肝IRI の著明な抑制をもたらしたと考えられた。

結論
　rTMD1 はリコモジュリンⓇから出血リスクを回避した新しい製剤であり、肝 IRI に対する予防薬としてのみならず、肝障害発生後に対する肝IRI の治療薬としても大いに期待できると考えられる

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