論文の公開元へArtificial T Cell Adaptor Molecule-Transduced TCR-T Cells Demonstrated Improved Proliferation Only When Transduced in a Higher Intensity
概要
【緒言】
腫瘍特異的T cell receptor(TCR)を遺伝子導入したCTL(TCR-CTL)が臨床応用を試みられているが、腫瘍を標的とした臨床試験では十分な効果を上げられていない。その原因の一部は、CTLの細胞増殖が不良であることと、体内でのCTLの持続時間が短いことである。これらの問題を解決するために、我々はCD3ζを基本骨格としCD28または4-1BBのintracellular domain(ICD)を内部に組み込んだartificial T cell adaptor molecule(ATAM)を開発した。TCRがHLA-ペプチド複合体と結合すると、細胞膜の荷電をよりどころにしてCD3ζとTCRが複合体を形成し、supramolecular activationクラスターを形成し、いくつかの内在性アダプター分子を介してLck、ZAP70などの下流のシグナルを増強する。我々は先行研究において下流の活性化シグナルの増強に注目し、CD3ζ-TCR複合体に含まれるATAMが、細胞内シグナルを増強させ、細胞増殖能を向上させることを示した。
CAR-T細胞において、CD28、4-1BBなどの共刺激因子をCAR-T細胞のICDに導入することで細胞増殖能と持続性の改善が得られ臨床的効果が得られた。本研究のATAMの着想はこの成功から得られている。当初我々は、CAR-T細胞の成功事例と同様にTCR α鎖、β鎖のICDに直接ATAMを結合させるコンストラクトを構築したが、CTLに発現させた遺伝子改変TCRは正確な構造をとらず、抗原を認識することができなかった。
我々の先行研究においてCD3ζに4-1BB ICDを組み込んだアダプター分子を細胞膜に導入することでCTLの細胞増殖能を向上させることができることを示した。今回我々は将来の臨床応用を念頭に、実現可能かつ効率的な患者末梢血由来T細胞へのTCRとATAMを遺伝子導入する方法の確立を目的として、一度の遺伝子導入で腫瘍特異的TCRとATAMを同時に遺伝子導入できるall-in-oneのvirus vectorの確立を試みた。結果としてall-in-oneのvirus vectorでは期待したATAMの有用性を観察できなかったが、ATAMの効果を得るためには、より高い表面密度のATAM発現が必要であることがわかった。
【結果】
TCR, ATAM, 細胞内領域を欠く遺伝子導入マーカーであるEGFR(tEGFR)をT2Aで結合させたcDNAをデザインした(one-virus-vector method[1vv method])(Fig.1A, B)。本研究ではTCRはHLA-A2に拘束性を持ち多発性骨髄腫、成人T細胞白血病／リンパ腫など多数の癌腫でがん抗原として確認されているNY-ESO-1を標的とするTCRを用いた。TCR-ATAMを遺伝子導入した際に、TCRが正確な構造を構築し抗原を認識することを、SUP-T1(T細胞性腫瘍細胞株)に遺伝子導入することで確認した(Fig.1C, D)。遺伝子導入マーカーとして用いたtEGFRは作成したコンストラクトすべてでほぼ同等の発現であった。
1vv methodによるCTLへのATAM導入の効果を確認するために、healthydonorより分離したCD8T細胞に遺伝子導入を行い評価した。CD3/CD28ビーズで刺激後、day3-4でTCR、ATAMを遺伝子導入し、day7に磁気ビーズを用いた純化を行った。純化前の遺伝子導入効率は約20%であり、純化後は73-99%であった(Fig.1E, F)。day11に凍結保存し、解凍後再刺激を行い下流の実験を行った。腫瘍に対するサイトカイン分泌を評価するために、intracellular cytokine assay、enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)を行ったが、ATAM導入によるサイトカイン産生の向上は認められなかった(Fig.2A-C)。腫瘍細胞を用いた単回刺激による細胞増殖を評価したが、ATAM導入による細胞増殖能の向上は認められなかった(Fig2.D)。CTLと腫瘍を1:1または1:8で共培養し、CTLと残存する腫瘍の比を経時的に測定することで腫瘍特異的細胞障害活性の評価を行ったが、ATAM導入による細胞傷害活性の向上は確認できなかった(Fig2E, F)。
以前の研究では、4-1BB-ATAMを導入することでCTLの細胞増殖能の向上を認めたが、今回の1vv methodではその効果を再現できなかった。1vv methodで効果を得られなかった理由を深く探求するために、1vv methodと先行研究で用いていたTCR-eGFPとATAM-tEGFRの二つのvirus vectorを用いて遺伝子導入するtwo-virus vector method(2vv method)を比較した(Fig.3A)。Jurkatに対し1vv method、2vv methodを用いて遺伝子導入を行い、1vv methodでは磁気ビーズを用いEGFR陽性細胞を純化し、2vv methodではcellsorterを用いてEGFR、eGFPの二重陽性細胞を分取し純化した。純化後の細胞を比較すると、ATAMと遺伝子として等量導入されているtEGFRのMFIは1vv methodで導入したCD28/CD3ζ ATAM、4-1BB/CD3ζ ATAMで低値であった(Fig.3B)。実際に蛋白発現しているATAMを抗CD3ζ抗体を用いたWestern blottingで比較すると、1vv methodは2vv methodよりも一貫して発現が弱く、特に4-1BB/CD3ζ ATAMで顕著であった(Fig.3C)。これらのデータから、2vv methodでは1vv methodと比べより高い細胞表面密度のATAMが導入できることがわかった。細胞表面のATAMの濃度が転写因子活性に与える影響を評価するために、Jurkat reporter細胞に遺伝子導入し、ATAMと等量遺伝子導入されているEGFRの発現量で分取した(Fig.4A)。分取した細胞のNY-ESO-1TCRの発現は同等であった(Fig.4B)。LCLで刺激し転写因子活性を評価した。この実験で用いたJurkat reporter細胞はNF-kBが活性化されるとCFPが発光するように遺伝子改変されており、CFPの発光を経時的に評価すると最もATAMの細胞表面濃度が多い細胞が最もNF-kBの活性が強かった(Fig.4C)。LCL刺激後1時間の細胞内リン酸化をflow cytometryを用いて評価すると、同じく最もATAMの細胞表面濃度が多い細胞が、最もErk、p53のリン酸化が強いことが示された(Fig.4D)。
1vv method、2vv methodの両者でTCR-CTLを作成し比較した。Jurkatにおける実験結果と同様に、2vv methodを用いて産生されたTCR-CTLの方が1vv methodと比べ、ATAMと等量遺伝子導入しているEGFRの発現が高かった。(Fig.5A, B)。NY-ESO-1TCRの発現は同等であった(Fig.5A)。腫瘍を用いた単回刺激を行いIL-7、IL-15存在下でのCTLの細胞増殖能の評価を行ったところ、ATAMの細胞表面濃度の低い1vv methodではコントロールと比べ細胞増殖の向上は認められなかったが、ATAMの細胞表面密度が高い2vv methodでは有意に細胞増殖能が向上した(Fig.5C)。
【考察】
本研究で1vv methodを用いてTCRとATAMを一度に遺伝子導入することができたが、ATAM導入による抗原刺激後の細胞増殖能の向上は確認できなかった。先行研究では2vv methodを用いており、1vv methodでATAMの効果が得られなかったメカニズムを解明するために1vv methodと2vv methodを比較した。
両者を比較した場合、Jurkat、CTLいずれにおいても2vvでのATAMの細胞表面密度が1vvと比べ高値であった。さらにJurkat reporter細胞では抗原刺激後のシグナル強度とATAMの細胞表面密度の間には相関関係があった。1vv methodにおいてTCRとATAMはT2Aで結合され、2vv methodにおいてはTCRとATAMが別々に遺伝子導入されている。遺伝子の長さは両者で異なっており、1vv methodでは3.6kb、2vv methodでは2.6kbと1.7kbである。遺伝子導入効率とその導入後の密度は遺伝子導入される遺伝子の長さに大きく依存することが知られており、遺伝子の長さがより短い2vv methodは有利であった。しかし本研究でATAMの効果が観察された2vv methodは、細胞純化に長時間が必要であり、得られる細胞数も少数であることから将来の臨床応用には不適であると考えている。ATAMの効果を得、さらに将来の臨床応用に有効な手法として、導入を目指す遺伝子の長さが遺伝子導入効率と相関しないと考えられているtransposon法などのウイルスを用いない遺伝子導入法や、二つのプロモーターを用いたベクターシステムが挙げられる。
ATAMの表面密度が低い1vv methodでATAMの効果が観察できなかった理由の一つとして、内在性のCD3ζの存在が挙げられる。T細胞表面には多数の内在性CD3ζが発現しており、ATAMの効果が観察されるためには相当量のATAM導入が必要であった可能性がある。 ATAMが細胞内シグナルを増強していても、その効果が内在性CD3ζにより希釈、干渉されその効果を観察することが難しかった可能性がある。Jurkat reporter細胞を用いた実験でATAMの細胞表面密度は直線的に高くなったと推測されるが、実際にATAMの効果が観察され細胞内シグナルが増強されたのはATAMの細胞表面濃度がある閾値を超えた場合のみであった。したがって2vv methodではより高い表面密度のATAMが発現した細胞を作成できたゆえに、2vv methodのみでATAMの効果が観察できた可能性がある。内在性CD3ζの希釈、干渉の可能性を除外するために、CRISPR-Cas9などのゲノム編集技術を用いてCD3ζをknock outを検討しているが、ゲノム編集されたT細胞は生体内での安全性の担保が困難であり将来の臨床応用には課題が残っている。
【結語】
CTLにATAMがより高い表面密度で遺伝子導入された場合に、その細胞増殖能の向上が認められる。1vv methodと2vv methodを比較した場合、2vv methodのみ高いATAMの表面密度が得られるためATAMの効果が観察される。
