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Transplantation of rat cranial bone-derived mesenchymal stem cells promotes functional recovery in rats with spinal cord injury

前田 雄洋 広島大学

2022.03.23

概要

脊髄損傷は恒久的な機能障害を引き起こす重症な疾患であるが、効果的な治療方法は確立されていない。近年、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells, MSCs)を用いた細胞移植による再生治療が脊髄損傷に対する新たな治療戦として注目されている。また、MSCsは骨髄や脂肪組織など様々な組織から樹立が可能である一方で、その供給源によって性質が異なることが報告されている。そのため MSCs を用いた移植治療において供給源選択は重要である。我々はすでに、神経堤由来である頭蓋骨から樹立した MSCsは、骨髄や脂肪組織由来の MSCs と比較して、神経栄養因子の発現が高いことを報告（Ootsuka, et al, 2021)、脳梗塞モデルラット対する移植効果を確認している(Abiko, et al, 2018)。そのため、頭蓋骨由来 MSCs は脊髄損傷など他の中枢神経系疾患への応用が期待されるが、脊髄損傷モデルへの移植効果は証明されていない。本研究では、脊髄損傷モデルラットにおけるラット頭蓋骨由来 MSCs (rcMSCs)による急性期移植効果の実証とその作用機序の解明を目的とした。比較対象はラット長管骨由来 MSCs(rbMSCs） とした。rcMSCsと rbMSCs はそれぞれラットの頭蓋骨と脛骨・腓骨骨髄から樹立した。

この reMSCs とrbMSCs を用いて以下の4系統の実験を行った。統計学的解析として、mRNA 発現の比較には Mann-Whitney の U 検定を、脊髄組織の Cavity rate や細胞の生存率の比較には一元配置分散分析を、神経機能回復の比較については繰り返しのある二元配置分散分析を用いた。有意水準 p 値が 0.05 未満を統計的に有意とみなした。

実験①：rcMSCsと rbMSCs の両者において real-time PCR 法を用い神経栄養因子であるBdnf、Gdnf、Ngf、VEGF と抗炎症サイトカインである Tgf-B と Tsg-6 の解析を行った。結果としてはrcMSCsで Bdnf, Ganf, VEGF が有意に高かった。

実験②：脊髄損傷（SCI) モデルラットを作成し、Ctrl 群(1=11:PBs 投与のみ)、rCMSCs群(n-11:roMSCs移植）と roMSCs 群(1-11:rbMSCs 移植)の3群に振り分けた。MSCsの移植は尾静脈から SCI 作成の24 時間後に行い、移植細胞数は 1.0x10°個とした。神経機能回復の評価には行動学的評価として BBB score と inclined plane task scoreを、電気生理学的評価として Motor evoked potential (MEP)を測定し波形の振幅の回復率を計算、それぞれ3群間で比較をおこなった。また移植後 28日目の脳組織を回収し、損傷部位の評価として香髄での空洞形成の程度から、Cavity rate を計算し、3群間で比較を行った。結果として、行動学的評価で、rcMSCs群において Ctrl群、rbMSCs 群に比しBBB score と inclined plane taskscore の有意な改善が見られた。MEP の回復率においても、rcMSCs 群でCtrl 群、rbMSCs 群に比して有意な改善が得られた。脊髄損傷部位の Cavity rate においてもrcMsCs群はCtl 群、IbMSCs 群に比して有意に小さい結果であった。

実験③:SCIモデルラットを作成し実験②同様に、Ctrl 群(1=7)、rcMSCs 群(ロ=6）とrbMSCs群(1-6)の3群を振り分けた。MSCs の移植は尾静脈から SCI 作成の24 時間後に行った。移植後 24 時間後に損傷部の脊髄組織を摘出し、real-time PCR 法を用い Bax/Bcl2 比、Caspase-3、INF-0. や IL-16の解析を行った。結果として、reMSCs 群ではCtl 群と比較してTNF-aやIL-16の発現が有意に低かった。

実験④：rcMSCs とrbMSCs の馴化培地をそれぞれ作成した。酸化ストレスおよび炎症性ストレスに暴露したマウス神経芽細胞腫/ラットグリオーマ細胞(NG108-15） にそれぞれの馴化培地を加えた rcMSC-CM 群とIbMSC-CM 群、通常の増殖培地のみの Ctrl 群をそれぞれ作成し、3群間で生存率を比較した。さらに real-time PCR 法を用い、アポトーシス経路に関与する因子である Bax/Bcl2 比、Caspase-3 やネクロ トーシス経路に関与する因子であるTnfrsfl、TER4、MLKL の解析をおこなった。結果としては炎症ストレス、酸化ストレス暴露双方において、rCMSC-CM 群は Cul 群と比較して生存率は有意に高かった。またroMSC-CM 群は Ctrl 群と比較して、炎症ストレス下では Tnfrsfl、TLR4や MLKLが有意に低く、酸化ストレス下では Bax/Bcl 比や Caspase-3が有意に低かった。

本研究で既知の報告同様に rcMSCs の性質として高い神経栄養因子の発現が確認できた。またSCIに対する rcMSCs の急性期移植効果を、すでに確立されている行動学的評価項目で実証するとともに、我々が近年報告している経時的な MEP 測定の技術(Maeda, et al., 2021)を応用し、電気生理学的にreMSCs移植による神経機能回復効果を実証することができた。raMSCs の脊髄損傷組織への作用機序については実験③、④の結果から、アポトーシス経路やネクロトーシス経路を介した細胞死への抑制的な関与が示唆された。実験①で rcMSCsにおいて高い発現を認めた Bdnf、Ganf、VEGF といった神経栄養因子については、炎症抑制、神経保護作用だけでなく、上記した細胞死経路への抑制作用(Li, et al,2012; Morrice, et al, 2017; Jiang, et al,2019; Montero, et al, 2020)が既に報告されている。急性期移植を行ったrcMSCs はその高い神経栄養因子の発現を介し、急性期脊髄損傷組織において抗炎症・抗細胞死作用を発揮することで、脊髄損傷による組織破壊を抑制し、高い神経機能回復や最終的な脊髄組織における Cavity rate の縮小につながったものと考えた。

rcMSCsは豊富な神経栄養因子を分泌する能力を持ち、SCIモデルラットへの移植にて有効な機能改善効果を示した。このことから頭蓋骨由来 MSCsは脊髄損傷に対する細胞移植において有力な選択肢となり得ることが示唆された。今後はヒト頭蓋骨由来 MSCs を用いた臨床応用が期待される。

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