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青色光作動性Gal4転写因子と近赤外光作動性Tet転写因子の哺乳類細胞における機能向上とその応用

長崎, 真治 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k24758

2023.03.23

概要

次世代シーケンス解析やイメージング技術の発展により、シングルセルレベルで遺
伝子発現動態やその制御機構が網羅的に解析されている。このような解析で観察され
た多様な遺伝子発現動態が、細胞や組織においてどのような機能を担っているかを検
証するには、その複雑な動態変化をシングルセルレベルで自在に制御できるような技
術の開発が必要である。近年、光遺伝学ツールの開発が進み、細胞内で数時間の周期
で振動発現パターンを誘導できるなど、遺伝子発現を光で制御できる様々な技術が発
展してきた。細胞が示す遺伝子発現変化は複雑であり、複数の遺伝子発現の相互作用
を通じて、時には、細胞の表現型の表出に繋がっていると考えられる。
これまでに、アカパンカビ Neurospora crassa 由来の光受容体 Vivid (VVD) を利
用した青色光作動性転写因子として、Gal4/UAS システムを基にした人工転写因子
hGAVPO が開発されている。しかしながら、哺乳類細胞に hGAVPO が高発現した
条件下では、暗所における遺伝子発現の誘導活性 (バックグラウンド活性) が非常に
高いことや、光量依存的な遺伝子発現量のコントロールが困難なことが欠点として挙
げられていた。これらの欠点は、遺伝子発現の光操作の信頼性を低下させ、定量的な
光操作の実現の障壁となっている。本研究では、光受容体 VVD を利用した光作動性
Gal4 転写因子の遺伝子発現の信頼性と光誘導能の向上を目的とし、VVD、Gal4
DNA 結合ドメイン、様々な転写活性化ドメインの最適な連結順序を評価した。その結
果、hGAVPO よりも、暗所でのバックグラウンド活性が非常に低い、かつ、光照射
下での転写活性が高い特徴を持った、機能向上型・青色光作動性 Gal4 転写因子
eGAV (enhanced Gal4-VVD 転写因子) を開発することに成功した。単発光照射に対
する転写活性の光応答性を評価したところ、eGAV は hGAVPO よりも、光照射後の
遺伝子発現誘導が速く、目的遺伝子の発現を 3 時間の周期で振動発現させることに成
功した。また、eGAV は光量依存的な転写活性を持ち、目的遺伝子の発現量を高精度
で光制御できることを示した。更に、eGAV を利用した実験の応用例として、哺乳類
培養細胞だけではなく、マウス胎仔脳や成体マウスの脳に存在する神経幹細胞や神経
前駆細胞、生体マウスの肝細胞、ニワトリ胚の脊髄に存在する神経前駆細胞や新生神
経細胞において、目的遺伝子の発現を光操作できることを示した。 ...

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謝辞

本研究は、京都大学大学院生命科学研究科 高次生命科学専攻 脳機能発達再生制御 今

吉研究室にて実施させて頂きました。今吉格教授と議論を重ねることで、数多くの知

見を深めることができました。また実験技術をご指導して頂いたことに加え、自身の

研究アイデアを積極的に試すことができる素晴らしい環境を与えてくださったこと

に、心より御礼申し上げます。山田真弓講師 (現・京都大学 医生物学研究所、特定准

教授) には、数多くの研究手法やアドバイスを親切丁寧にご指導していただきまし

た。今後の研究活動の基盤となる技術を伝授して頂いたことを深く感謝致します。ま

た、鈴木裕輔助教には、光作動性転写因子の時間的な定量に関してサポートして頂

き、GUY Adam Tsuda 准教授には、ニワトリ胚における eGAV の遺伝子導入に関

してサポートして頂きました。eGAV-eMag の実験では、福田智徳大学院生にサポー

トして頂きました。本研究の迅速な遂行にご助力頂いたことを深く感謝致します。

今吉研究室と影山研究室 (元・医生物学研究所、現・理化学研究所 脳神経科学研究セ

ンター) のメンバーと定期的に議論させていただいたことは、自身の研究を客観的に

捉える機会に繋がりました。また、京都大学大学院 生命科学研究科/医学研究科 松田

道行教授、寺井健太准教授 (現・京都大学 医学研究科、准教授)、小鉢健樹大学院

生、基礎生物学研究所 定量生物学研究部門 青木一洋教授、宇田耀一博士、理化学研

究所 脳神経科学研究センター 宮脇敦史教授には、本研究の迅速な遂行にご助力頂き

ました。深く感謝致します。

本研究は、日本学術振興会特別研究員制度 (DC1) のご支援を賜りましたこと、深く

感謝申し上げます。

最後になりましたが、本研究に携わってくださった皆様に心より感謝申し上げます。

本学位論文は、以下の学術論文の内容に基づいて書かれたものである。

NAGASAKI, S. C., FUKUDA, T. D., YAMADA, M., SUZUKI, Y., III, KAKUTANI,

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80

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