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Retinoic acid regulates erythropoietin production cooperatively with hypoxia-inducible factors in human iPSC-derived erythropoietin-producing cells

Katagiri, Naoko 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23466

2021.09.24

概要

【背景、目的】
赤血球造血に必須のホルモンであるエリスロポエチン（EPO）は、胎生期には肝臓で、また、成体では主に腎臓において産生されるため、進行した慢性腎臓病（CKD）患者ではEPO の産生低下により腎性貧血が発症する。腎性貧血に対して遺伝子組換えヒトEPO製剤の投与が行われているが、間欠的投与によるヘモグロビン値の変動が心血管疾患のリスクを上昇させるため、より生理的な新規治療薬の開発が期待されている。低酸素誘導性因子（HIF）は主たる EPO 産生制御因子として知られているが、その他の EPO 産生制御機構の詳細は明らかになっていない。本研究では、ヒト iPS 細胞由来 EPO 産生細胞（hiPSC-EPO 細胞）、及び、腎性貧血モデルマウスを用いてEPO 産生におけるレチノイン酸（RA）の役割の解明を目的とした。

【方法、結果】
はじめに、マウスの胎生初期肝臓においてEPO 産生にRA が必須である知見に着目し、 hiPSC-EPO細胞を用いてEPO産生制御におけるRAとHIFシグナルの関連を検証した。まず、通常酸素濃度培養条件下でall-trans RA（ATRA）単独投与を行った場合、あるいは、低酸素条件で培養を行った場合のEPO 産生増加量はわずかであるのに対し、低酸素条件でATRA を投与した場合、及び、通常酸素条件でHIF の上方制御に働くプロリン水酸化酵素（PHD）阻害剤FG4592 とATRA を併用した場合に、EPO 産生量は増強した。

次に、EPO 産生におけるRA とHIF シグナルの相互作用のメカニズムを解明するため、細胞増殖や細胞の分化状態の変化について検討したが、低酸素条件で ATRA 投与を行った場合に、細胞数や分化状態を規定する主たるマーカー遺伝子の発現に有意な変化を認めなかった。そこで、低酸素によるクロマチン構造の変化がRA のEPO 転写調節を可能にするという仮説を立て、網羅的オープンクロマチン領域解析（ATAC-sequencing）を用いて検証した。その結果、EPO 転写開始点の近傍に低酸素条件によりオープンクロマチン構造をとる領域を見出した。同領域に対するモチーフ解析では 13 個の EPO 転写調節候補因子が同定され、それらの遺伝子発現を評価したところ、RFX6 と EBF1 は低酸素条件におけるATRA 投与により有意な変化を認めた。

最後に、RA とHIF シグナルによるEPO 産生量の増強をin vivo において検証した。hiPSC-EPO 細胞は肝系譜の細胞であることから、まず、成体腎における RA とHIF シグナルの併用効果を確認するため、成体マウス腎臓の切片を培養し、RA とPHD 阻害剤を投与する実験を行った。その結果、ATRA とFG4592 の併用によりEPO の発現は有意に増加したため、RA とHIF シグナルは、胎児肝のみならず、成体腎においてもEPO 産生を制御することが示唆された。次に、RA とPHD 阻害剤の併用療法の効果について、アデニン投与による慢性腎不全・腎性貧血モデルマウスを用いて検討したところ、ATRAとFG4592 の併用療法群においてのみ、ヘマトクリット値の有意な改善が認められた。

【考察、結論】
RA はhiPSC-EPO 細胞においてHIF シグナルと協調してEPO 産生制御を行うことを明らかにした。また、腎性貧血モデルマウスにおいてRA とPHD 阻害剤の併用により腎性貧血は改善した。hiPSC-EPO 細胞は EPO 産生メカニズムの解明、及び、腎性貧血の新規治療薬開発に有用であることが示唆された。

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