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Studies on self-organization propety of Plk4 in centriole duplication

山本, 昌平 東京大学 DOI:10.15083/0002004233

2022.06.22

概要

[序論]
中心小体は、タンパク質の複合体から形成される非膜系の細胞小器官であり、動物細胞における中心体・繊毛・鞭毛形成に必要とされる。中心小体を核として形成された中心体は、微小管形成中心として細胞分裂時の紡錘体や細胞極性の形成に重要な働きをしている。中心小体はDNAと同様にG1/S期に一度だけ複製され、母中心小体に対し”一つ”だけ娘中心小体が形成される。中心小体の消失や過剰な複製は、小頭症や癌の悪性化などヒト疾患の原因の一つとされており、適切な細胞の機能を保証するために中心小体の複製は厳密に制御されなければならない。しかしながら、中心小体の複製数を制御する基本原理は未解明のままである。

先行研究により、中心小体複製に必要な因子が複数同定されており、その中でもPolo-likekinase4(Plk4)というリン酸化酵素が進化的保存された必須因子として同定された。Plk4の欠損やリン酸化活性の阻害は中心小体の複製エラーによる中心小体の消失を誘導し、一方でPlk4の過剰発現は娘中心小体の過剰複製を誘導することが知られている。しかし、母中心小体に対し”一つ”だけ娘中心小体を形成するために、Plk4の局在や活性がどのように制御されているのかは明らかになっていない。そこで、本研究では、中心小体複製の基本原理の解明を目指し、Plk4の未知の分子特性の探索を試みた。

[結果]
1.試験管内におけるPlk4の可溶性は自己リン酸化によって変化する
Plk4の未知の分子特性を探索するために、ヒトPlk4タンパク質の試験管内における特性を調べた。その中で、Plk4の不活性化型変異体は野生型と比較して高度に不溶化することを偶然発見した(図1)。さらに、既知の自己リン酸化サイトをアラニン置換した非リン酸化型変異体も同様に不溶化することがわかった。これらの結果から、Plk4は自身の可溶性を自己リン酸化によって変化させる性質をもつことが明らかになった。

2.細胞内Plk4の自己凝集特性は自己リン酸化によって制御される
細胞内におけるPlk4の分子特性を調べるために、ヒト培養細胞内のPlk4の挙動を観察した。その結果、過剰発現したPlk4が自身の天然変性領域依存的に凝集体を形成することがわかった。Plk4凝集体の挙動を詳細に観察した結果、凝集体は球状の構造を示し、凝集体同士が融合する性質をもつことがわかった。光褪色後蛍光回復法(FRAP)によってGFPPlk4凝集体の動態を調べると、Plk4凝集体は動的な蛍光回復を示した(図2)。これらの結果から、Plk4は凝集によって液-液相分離を起こす特性を持つことが示唆された。また、大腸菌から精製したPlk4タンパク質でも同様に天然変性領域依存的に凝集体形成が観察されたことから、Plk4は自己凝集する性質を持つと結論づけた。

次に、自己リン酸化によってPlk4の凝集特性が変化するかどうかを調べた。FRAPの結果、野生型のPlk4凝集体と比べ、不活性化型と非リン酸化型Plk4凝集体は顕著に遅い蛍光回復を示した(図2)。この結果から、Plk4の凝集状態が自己リン酸化によって制御されることが示唆された。重要なことに、過剰発現によって誘導した細胞内凝集体だけでなく、中心小体上のPlk4も同様に自己リン酸化依存的な動態変化を示した。

3.Plk4の凝集状態と中心小体の複製効率の関係
Plk4の自己凝集特性と自己リン酸化による凝集状態の変化が中心小体複製に関与するのかを調べるために、非リン酸化型Plk4をヒト培養細胞に発現させ、中心小体の数を観察した。その結果、野生型と比較して、非リン酸化型Plk4の発現によって中心小体の過剰な複製が誘導されることがわかった(図3)。さらに、非リン酸化型のアラニン変異数・位置を変化させることで、Plk4の凝集状態の変化と中心小体の過剰複製数に強い相関があることが示された。これらの結果から、Plk4の自己組織化特性が中心小体複製の制御に関与することが示唆された。

Plk4の自己凝集特性の意義を調べるために、Plk4の自己リン酸化サイトに対する抗体を用いて母中心小体におけるPlk4の活性状態を調べた。その結果、野生型と比較して、静的な凝集性を示す非リン酸化型Plk4はより高い自己リン酸化量を示した。この結果から、Plk4は凝集状態の変化によって中心小体上の活性化Plk4の量を制御しうることがわかった。

4.中心小体複製時におけるPlk4の自己リン酸化状態の解析
中心小体複製時のPlk4の自己リン酸化状態を詳細に観察したところ、娘中心小体の形成に必要なPlk4の下流因子の局在前に、Plk4の局在量の増加にともなって自己リン酸化状態が亢進していることがわかった。さらに、3D-SIM(Structured illumination microscopy)を用いた観察の結果、母中心小体上のPlk4の局在量と自己リン酸化状態は不均一な偏りを示した。これらの観察結果から、娘中心小体複製前に母中心小体上でPlk4のリン酸化活性の偏りが生じている可能性があることがわかった。

[考察]
本研究は、Plk4が自己凝集する性質を持ち、自己リン酸化によって自己凝集体の物性を変化するというPlk4の自己組織化特性を明らかにした。また、Plk4の凝集特性が中心小体の複製効率に関与することが示唆された。これらの結果から、Plk4の自己組織化特性は中心小体の複製数の決定因子の1つではないかと考えている。では、どのようにPlk4の自己組織化特性が中心小体複製を制御するのだろうか?Plk4はG1期に母中心小体の周囲にリング状に局在することが知られている。また、Plk4のリン酸化活性は、娘中心小体の形成に必要な下流の因子の招集に必要であることが明らかになっている。本研究の観察により、母中心体上のPlk4の自己リン酸化状態に偏りが生じていることが示唆された。そこで、Plk4の自己凝集と自己活性化を介した自己組織化によって、母中心小体上で活性化Plk4ドメインが生じることで、母中心小体に対し一つの娘中心小体の複製点が形成されるのではないかと考えている(図4)。また近年、細胞内分子の凝集体形成が、特定の分子を特定の空間に濃縮するために機能していることが明らかになっていることから、Plk4の凝集体形成能は娘中心小体形成に必要な因子の効率的な中心小体局在のために働いている可能性があると考えている。

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