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熱耐性変化を指標とした化合物結合タンパク質同定法の利用に関する研究

掛川 純矢 東北大学

2022.03.02

概要

近年，医薬品開発において，標的ベースのスクリーニングと比較して細胞系を利用した表現型スクリーニングが注目されている1,2。その理由の一つとして，表現型スクリーニングでは，病態を模倣した細胞系で期待する表現型を示す化合物を探索できるため，見出した化合物は病態モデル動物や臨床試験においても有効性を示す可能性の高いことが挙げられる。また，未知の機序を介して期待する表現系を示す化合物を取得できるという魅力もある。実際，1999年から2008年の間に見出されたfirst-inclassの薬物は，その多くが表現型スクリーニングによって見出された化合物に由来することが報告されている3。さらに，iPS細胞やオルガノイドなどの技術革新により，これまでよりも病態や生体を反映した高次の評価系を構築することが可能となってきた。このような状況を背景に，多くの製薬企業や大学で表現型スクリーニングが実施されている。しかし，見出される化合物はその標的分子が不明であり，化合物の詳細な分子メカニズムは明らかではない。そのため，予期せぬ副作用の生じるリスクや，細胞系で表現型のみを指標として化合物の合成展開を進めなければならないという問題点を有する。ここで，化合物の結合タンパク質を同定する技術は，化合物の標的分子を見出すことで分子メカニズムを明確化できるため，医薬品開発のプロセスに大きく貢献できると考えられる。

化合物の結合タンパク質同定では，化合物固定化担体を利用したアフィニティークロマトグラフィーが最も一般的な方法である4,5。ただし，この手法は細胞溶解液を探索材料とするため，溶解時に構造が維持されない膜タンパク質には適応できない。また，化合物とタンパク質との相互作用は，担体との立体障害によって阻害されるなどの課題がある。このような課題を解決するために，様々な取り組みがなされてきた。例えば，膜タンパク質でも対応できる手法として，ジアジリンなどの光反応基を化合物に導入したphoto affinity labeling法が開発された6。この手法では，化合物とタンパク質が結合している際に光照射を行うことで両者を共有結合させることができる。膜構造が保持された生細胞を探索材料とできるため，化合物の結合タンパク質が膜タンパク質の場合でも同定可能である。また，光反応基とは異なる求核性の反応基を導入し，より効率的に結合タンパク質を標識できるligand-directed chemistryなども報告されている7。担体と化合物結合タンパク質との立体障害については，担体と化合物を繋げるリンカーに連続したプロリンを導入して直線的にし，立体障害を低減するという取り組みがなされている8。このように，化合物の結合タンパク質同定技術は様々な化学的工夫により進展を遂げてきた。しかし，化合物に様々な修飾を施すと，タンパク質に対する化合物のアフィニティーは低下する場合が多い。特に主活性の低い化合物は，結合タンパク質の探索可否に大きな影響を受ける。また，特殊な反応基を含む化合物を合成することは合成期間の長期化に繋がり，研究の効率が低下する。そのため，化学修飾を施さずに，未修飾の化合物で結合タンパク質を同定する技術の開発が必要である。

近年，未修飾の化合物で結合タンパク質を同定する手法がいくつか報告されている。それらは，化合物の結合したタンパク質はその性状が変化することを利用している手法が多い。例えば，プロテアーゼ耐性変化を指標としたdrug affinity responsive target stability （DARTS）法や，酸化率変化を指標としたstability of proteins from rates of oxidation （SPROX）法などが挙げられる9。中でも，熱耐性変化を指標としたthermal proteome profiling（TPP）法は，生細胞からの結合タンパク質探索も可能という特徴を有し，化合物結合タンパク同定の報告例が増えている10。

オートファジー誘導作用を有する天然物のコノフィリンは，複雑な構造を有するために合成難度が高く，任意の部位に化学修飾を施すことは難しい。そこで本研究では，コノフィリンの結合タンパク質を，化学修飾を必要としないTPP法にて探索した（第1章）。続いて，見出した結合タンパク質が，オートファジーの誘導に関与しているか検討した（第2章）。以上の取り組みから得られたTPP法の利用に関する知見を，従来法である化合物固定化担体を利用したアフィニティークロマトグラフィーの事例（JTP-74057/第3章，JTE-607/第4章）と照らし合わせることで，未修飾化合物による化合物結合タンパク質同定の利点と欠点を整理した。

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