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Extracellular vesicles of stem cells to prevent BRONJ

Watanabe, Junna 渡邊, 純奈 名古屋大学

2020.05.14

概要

【緒言】
　ビスフォスフォネート（BP）製剤は、破骨細胞の機能を抑制することにより骨吸収を阻害する薬剤で、骨転移を有するがん患者および骨粗鬆症患者の治療に広く用いられている。しかし、高用量で長期間服用すると稀にBP関連顎骨壊死（BRONJ）が発症する。放射線照射歴がなく、8週間以上継続した露出壊死骨を認める場合に診断され、痛み、排膿、悪臭など、患者の生活の質を著しく低下させる。しかし、その発症の詳細なメカニズムは不明のままであり、適切な予防法や治療法は確立されていない。
　一方、細胞外小胞（EVs）は、細胞から分泌される核を持たない脂質二重膜に囲まれた粒子で、タンパク質・脂質・RNAなどの細胞間輸送の媒体として機能することにより、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たす。また、間葉系幹細胞（MSC）由来のEVs（MSC-EVs）が様々な疾患に対して治療効果を持つことが報告されつつある。そこで本研究ではMSC-EVsが、創傷治癒を促進することによりBRONJの発生を防ぐのではないかと仮定した。

【方法】
　EVsはヒト骨髄由来MSCの培養上清（FBS不含）から超遠心法で回収した。EVsは透過型電子顕微鏡、粒径測定、Western blotting（CD9・CD63・CD81）で確認した。さらにEVsをPKH26で蛍光標識し、細胞内への取り込みを評価した。
　In vivoでは9週齢Wistar/STラットに、BP製剤の一つであるゾレドロン酸（ZOL）を投与し抜歯をしてモデルを作製した（Fig. 2A）。抜歯の翌日にEVsを投与する（ZOL+EVs）群と投与しない（ZOL+PBS）群、コントロールとしてZOLを投与せず抜歯のみをする（control）群を設定した。それぞれμCT、ヘマトキシリン-エオジン染色、蛍光免疫染色（β-ガラクトシダーゼ・CD90・periostin・VEGFR2・CD31）、qRT-PCR（p21・pRB・IL-6・IL-8・MMP1・MMP3・VEGF・Bmi1・Hgma2）で評価した。
　In vitroではラット骨髄細胞とヒト線維芽細胞に100μMのZOLを投与して培養し、その24時間後にEVsを投与する（ZOL+EVs）群と投与しない（ZOL+PBS）群、コントロールとしてZOLを投与せず培養する（control）群を設定した。それぞれ蛍光免疫染色（β-ガラクトシダーゼ）、qRT-PCR（p21・pRB・IL-6・IL-8・MMP1・MMP3）、wound healing assay、WST-8で評価した。また、破骨細胞やがん細胞に対するEVsの影響を確認するため、TUNEL assay、TRAP染色、wound healing assay、WST-8をした。

【結果】
　回収したEVsは約100nmの粒子で、表面マーカーであるCD9・CD63・CD81が発現していた（Fig. 1A, 1B, 1C）。PKH26にて標識したEVsは標的とする細胞質内に取り込まれることを確認した（Fig. 1D）。
　In vivoにおいて、抜歯後2週間および8週間のどちらも、ZOL+PBS群では抜歯窩の一部は口腔上皮に覆われず骨が露出した（Fig.2B, 2D, 2E: p=0.014）。一方、ZOL+EVs群では抜歯窩は上皮で覆われた（Fig.2B, 2D, 2E: p=0.02）。μCT画像を3D構築し、抜歯窩の組織あたりの硬組織の割合を比較すると、これはZOL+PBS群よりもZOL+EVs群で高かった（Fig.2F: Day7; p<0.001, Day14; p=0.002）。
　In vitroにおいて、骨髄細胞と線維芽細胞のどちらもZOL+PBS群は細胞老化に特徴的なβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞数（Fig. 3A, 3B: p<0.001, 3C: p<0.001）と老化関連遺伝子p21やpRB、炎症性サイトカインの発現が増加した（Fig. 3D: p<0.001）。細胞増殖能は低下した（Fig. 3E, 3F: bone marrow cells; p=0.013, fibroblasts; p<0.001, 3G: bone marrow cells; p<0.001, fibroblasts; p=0.001）。一方、ZOL+EVs群ではβ-ガラクトシダーゼ陽性の老化細胞は少なく（Fig. 3A, 3B: p<0.001, 3C: p<0.001）、p21とpRB、炎症性サイトカインの遺伝子発現も減少した（Fig. 3D: p21; p=0.002, それ以外; p<0.001）。細胞増殖能は上昇した（Fig. 3E, 3F: bone marrow cells; p=0.005, fibroblasts; p<0.002, 3G: bone marrow cells; p<0.001, fibroblasts; p=0.002）。
　そこで、ラットの組織中で老化細胞の局在を評価した。ZOL+PBS群では抜歯窩内にβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞が存在し、その局在はCD90（幹細胞マーカー）陽性、periostin（骨芽細胞マーカー）陽性の細胞と一致した（Fig. 4A, 4B, 4E: p<0.001）。しかし、ZOL+EVs群ではβ-ガラクトシダーゼ陽性細胞は存在せず（Fig. 4A, 4B）、幹細胞の自己複製を促進する遺伝子であるBmi1、Hmga2の発現はZOL+PBS群よりも増加した（Fig. 4G: Bmi1; p<0.001, Hmga2; p=0.004）。さらに、組織中の老化関連遺伝子の発現も評価した。ZOL+PBS群ではp21やpRB、炎症性サイトカインの発現が増加したが（Fig. 4F: p21, IL-6, IL-8, MMP3; p<0.001, pRB; p=0.001, MMP1; p=0.008）、ZOL+EVs群ではp21とpRB、炎症性サイトカインは減少した（Fig. 4F: p21, IL-6, IL-8, MMP3; p<0.001, pRB; p=0.007, MMP1; p=0.017）。血管新生では、ZOL+PBS群でVEGF遺伝子は減少し（Fig. 4F: p<0.001）、VEGFR2陽性細胞、CD31陽性細胞は少ない傾向にあった（Fig. 4C, 4D）が、ZOL+EVs投与群でVEGF遺伝子は増加し（Fig. 4F: p<0.001）、VEGFR2陽性細胞、CD31陽性細胞は多い傾向にあった（Fig. 4C, 4D）。
　また、ZOLは破骨細胞に対してアポトーシスを引き起こしたが、EVsを投与してもアポトーシス数は変化しなかった（Fig. 5A, 5B: p=0.643, 5C）。がん細胞に対しては、ZOLの抗腫瘍効果により増殖能は低下したが、EVsを投与しても上昇しなかった（Fig. 5D: p=0.766）。

【考察】
　細胞老化は、健康な細胞がさまざまな原因により修復不可能なDNA損傷を受ける場合、アポトーシスと同様に、危険な細胞の成長を防ぐ生体防御メカニズムとして機能する。本研究ではZOLによって破骨細胞はアポトーシスに陥るが、骨芽細胞、幹細胞および線維芽細胞は老化を引き起されることを初めて報告した。また、老化細胞はSenescence-associated secretory phenotype（SASP）と総称される、サイトカインやケモカインを分泌し、好ましくない微小環境を周囲の組織に提供する。本研究でもZOL投与後にSASPに含まれるIL-6・IL-8・MMP1・MMP10が増加し、BRONJの慢性炎症と創傷治癒の遅延を引き起こすメカニズムの一つであることが示唆された。一方、EVs投与による骨芽細胞、幹細胞の細胞老化が抑制された結果、SASPが減少し、健康な創傷治癒につながった可能性がある。
　BPを使用しながらBRONJの予防に役立つのは、ZOLの効果を阻害せずに利用できる、つまり破骨細胞アポトーシスを阻害せず、がん細胞の増殖を促進しないことである。結果より、MSC-EVsがこれらを達成し、BRONJを未然に防ぐ薬になりうる可能性が示唆された。ただし、MSC-EVsの欠点は、MSCの大量培養後にEVsを抽出するのが煩雑で、EVsの保管状態によっては、安定性と機能に影響を与える。治療用量や頻度はさらに検討すべきである。今後もさらなる研究が必要であるが、MSC-EVsは細胞移植による肺塞栓症などのリスクを回避する治療法として期待されるだけでなく、患者の生活の質を維持しながら、侵襲性が低く、信頼性の高い治療法の開発につながると考えている。

【結論】
　MSC-EVsの投与は、創傷治癒に影響を与える老化細胞と、老化細胞による周囲への慢性炎症の波及を防ぐだけでなく、血管新生および骨再生を促進してBRONJを予防することが示唆された。

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Acosta JC, Banito A, Wuestefeld T, Georgilis A, Janich P, Morton JP, Athineos D, Kang TW, Lasitschka F, Andrulis M, et al. 2013. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 15(8):978-990.

Acosta JC, O’Loghlen A, Banito A, Guijarro M V., Augert A, Raguz S, Fumagalli M, Da Costa M, Brown C, Popov N, et al. 2008. Chemokine signaling via the CXCR2 receptor reinforces senescence. Cell. 133(6):1006-1018.

Bruno S, Grange C, Deregibus MC, Calogero RA, Saviozzi S, Collino F, Morando L, Busca A, Falda M, Bussolati B, et al. 2009. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. J Am Soc Nephrol. 20(5):1053-1067

Campisi J, d’Adda di Fagagna F. 2007. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8(9):729-740.

Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J. 2007. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25(11):2739-2749.

Chen L, Tredget EE, Wu PYG, Wu Y, Wu Y. 2008. Paracrine factors of mesenchymal stem cells recruit macrophages and endothelial lineage cells and enhance wound healing. PLoS One. 3(4):e1886.

Fournier P, Boissier S, Filleur S, Guglielmi J, Cabon F, Colombel M, Clézardin P. 2002. Bisphosphonates inhibits angiogenesis in vitro and testosterone-stimulated vascular regrowth in the ventral prostate in castrared rats. Cancer Res. 62(22):6538-6544.

Fujita H, Kurokawa K, Ogino T, Ono M, Yamamoto M, Oka T, Nakanishi T, Kobayashi N, Tanaka N, Ogawa T, et al. 2011. Effect of risedronate on osteoblast differentiation, expression of receptor activator of NF-κB ligand and apoptosis in mesenchymal stem cells. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 109(2):78-84.

Hokugo A, Christensen R, Chung EM, Sung EC, Felsenfeld AL, Sayre JW, Garrett N, Adams JS, Nishimura I. 2010. Increased prevalence of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw with vitamin D deficiency in rats. J Bone Miner Res. 25(6):1337-1349

Ide C, Nakai Y, Nakano N, Seo TB, Yamada Y, Endo K, Noda T, Saito F, Suzuki Y, Fukushima M, Nakatani T. 2010. Bone marrow stromal cell transplantation for treatment of sub-acute spinal cord injury in the rat. Brain Res. 1332:32-47.

Karnoub AE, Dash AB, Vo AP, Sullivan A, Brooks MW, Bell GW, Richardson AL, Polyak K, Tubo R, Weinberg RA. 2007. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449(7162):557-563.

Katsuda T, Ochiya T. 2015. Molecular signatures of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle-mediated tissue repair. Stem Cell Res Ther. 6:212.

Khosla S, Burr D, Cauley J, Dempster DW, Ebeling PR, Felsenberg D, Gagel RF, Gilsanz V, Guise T, Koka S, et al. 2007. Bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaw: report of a task force of the American Society for Bone and Mineral Research. J Bone Miner Res. 22(10):1479-1491.

Khurana S, Verfaillie CM. 2013. Periostin acts as an important cell cycle regulator of adult hematopoietic stem cells via binding to integrin-αvβ3. Blood.122(21):341.

Kikuiri T, Kim I, Yamaza T, Akiyama K, Zhang Q, Li Y, Chen C, Chen WJ, Wang S, Le AD, Shi S. 2010. Cell-based immunotherapy with mesenchymal stem cells cures bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw-like disease in mice. J Bone Miner Res. 25(7):1668-1679.

Kim RH, Lee RS, Williams D, Bae S, Woo J, Lieberman M, Oh JE, Dong Q, Shin KH, Kang MK, Park NH. 2011. Bisphosphonates induce senescence in normal human oral keratinocytes. J Dent Res. 90(6):810-816.

Kordelas L, Rebmann V, Ludwig A-K, Radtke S, Ruesing J, Doeppner TR, Epple M, Horn PA, Beelen DW, Giebel B. 2014. MSC-derived exosomes: a novel tool to treat therapy-refractory graft-versus-host disease. Leukemia. 28(4):970-973

Lai RC, Chen TS, Lim SK. 2011. Mesenchymal stem cell exosomes: a novel stem cell-based therapy for cardiovascular disease. Regen Med. 6(4):481-492

Li Y, Xu J, Mao L, Liu Y, Gao R, Zheng Z, Chen W, Le A, Shi S, Wang S. 2013. Allogeneic mesenchymal stem cell therapy for bisphosphonate-related jaw osteonecrosis in swine. Stem Cells Dev. 22(14):2047-2056.

Liao Z, Luo R, Li G, Song Y, Zhan S, Zhao K, Hua W, Zhang Y, Wu X, Yang C. 2019. Exosomes from mesenchymal stem cells modulate endoplasmic reticulum stress to protect against nucleus pulposus cell death and ameliorate intervertebral disc degeneration in vivo. Theranostics. 9(14):4084-4100.

Liu J, Cao L, Chen J, Song S, Lee IH, Quijano C, Liu H, Keyvanfar K, Chen H, Cao LY, et al. 2009. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. 459(7245):387-392.

Matsubara K, Matsushita Y, Sakai K, Kano F, Kondo M, Noda M, Hashimoto N, Imagama S, Ishiguro N, Suzumura A, et al. 2015. Secreted ectodomain of sialic acid-binding Ig-like lectin-9 and monocyte chemoattractant protein-1 synergistically regenerate transected rat peripheral nerves by altering macrophage polarity. J Neurosci. 35(6):2452-2464.

Mummery CL, Davis RP, Krieger JE. 2010. Challenges in using stem cells for cardiac repair. Sci Transl Med. 2(27):27ps17

Ogata K, Katagiri W, Osugi M, Kawai T, Sugimura Y, Hibi H, Nakamura S, Ueda M. 2015. Evaluation of the therapeutic effects of conditioned media from mesenchymal stem cells in a rat bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw-like model. Bone. 74:95-105.

Osugi M, Katagiri W, Yoshimi R, Inukai T, Hibi H, Ueda M. 2012. Conditioned media from mesenchymal stem cells enhanced bone regeneration in rat calvarial bone defects. Tissue Eng. 18(13-14):1479-1489.

Phinney DG, Pittenger MF. 2008. Concise review : MSC-derived exosomes for cell-free therapy. Stem Cells. 35(4):851-858.

Plotkin LI, Manolagas SC, Bellido T. 2006. Dissociation of the pro-apoptotic effects of bisphosphonates on osteoclasts from their anti-apoptotic effects on osteoblasts/osteocytes with novel analogs. Bone. 39(3):443-452.

Raposo G, Stoorvogel W. 2013. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200(4):373-383.

Rodier F, Campisi J. 2011. Four faces of cellular senescence. J Cell Biol. 192(4):547-556.

Ruggiero SL, Dodson TB, Fantasia J, Goodday R, Aghaloo T, Mehrotra B, O’Ryan F. 2014. American association of oral and maxillofacial surgeons position paper on medication-related osteonecrosis of the jaw - 2014 update. J Oral Maxillofac Surg. 72(10):1938-1956.

Russell RGG, Watts NB, Ebetino FH, Rogers MJ. 2008. Mechanisms of action of bisphosphonates: similarities and differences and their potential influence on clinical efficacy. Osteoporos Int. 19(6):733-759.

Sonis ST, Watkins BA, Lyng GD, Lerman MA, Anderson KC. 2009. Bony changes in the jaws of rats treated with zoledronic acid and dexamethasone before dental extractions mimic bisphosphonate-related osteonecrosis in cancer patients. Oral Oncol. 45(2):164-172.

Théry C, Witwer KW, Aikawa E, Alcaraz MJ, Anderson JD, Andriantsitohaina R, Antoniou A, Arab T, Archer F, Atkin-Smith GK, et al. 2018. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7(1):1535750.

Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. 2008. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8(9):726-736.

Urbanowitz G, Yanagihara R, Zheng M, Gordon D, Rosen LS, Hirsh V, Krzakowski M, Pawlicki M, de Souza P, Tchekmedyian S, et al. 2003. Zoledronic acid versus placebo in the treatment of skeletal metastases in patients with lung cancer and other solid tumors: a phase III, double-blind, randomized trial--the zoledronic acid lung cancer and other solid tumors study group. J Clin Oncol. 21(16):3150-3157.

Valadi H, Ekström K, Bossios A, Sjöstrand M, Lee JL and Lötvall JO. 2007. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9(6):654-659.

Yamazaki H, Mori T, Yazawa M, Maeshima AM, Matsumoto F, Yoshimoto S, Ota Y, Kaneko A, Tsuda H, Kanai Y. 2013. Stem cell self-renewal factors Bmi1 and HMGA2 in head and neck squamous cell carcinoma: clues for diagnosis. Lab Investig. 93(12):1331-1338.

Yokoi A, Yoshioka Y, Yamamoto Y, Ishikawa M, Ikeda S, Kato T, Kiyono T, Takeshita F, Kajiyama H, Kikkawa F, et al. 2017. Malignant extracellular vesicles carrying MMP1 mRNA facilitate peritoneal dissemination in ovarian cancer. Nat Commun. 8:14470.

Zhang L, Chan C. 2010. Isolation and enrichment of rat mesenchymal stem cells (MSCs) and separation of single-colony derived MSCs. J Vis Exp. (37):1852.

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