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歯髄幹細胞の分泌因子は、制御性T細胞による免疫抑制を介してシェーグレン症候群を改善する

川島（松村）, 万由 MATSUMURA-KAWASHIMA, Mayu カワシマ（マツムラ）, マユ 九州大学

2021.09.24

概要

近年、幹細胞を使用した組織再生は、細胞自体が分化増殖し組織を再生させるのではなく、幹細胞の分泌因子によるパラクライン効果が主であるといわれている。分泌因子は、培養上清（CM）中に多量に含まれていることが分かっている。また、幹細胞の種類により分泌因子にも違いがあることが過去の報告でわかっている。その中でも、ヒト歯髄幹細胞（DPSC）は、侵襲を伴わず簡便に採取できることと分離培養が可能であること、DPSCが放出する分泌因子中に免疫抑制因子や抗炎症効果のある分泌因子を多く含んでいることも分かっている。そこで、難病指定されており、根本的治療法がいまだ確立されていない自己免疫疾患であるシェーグレン症候群（SS）に対して、DPSCのCM（DPSC-CM）を投与することで、治療効果が期待できないかと考えた。SSは臓器特異的自己免疫疾患であり、免疫担当細胞、特にヘルパーT（Th）細胞とそのサブセットが放出するサイトカインがその病態に関与しているといわれている。CMは組織再生能だけではなく、免疫抑制作用・抗炎症作用があるため、SS動物モデルに投与することで病態改善効果があるかどうか、またそのメカニズムについて検索することを本研究の目的とした。

　まずは、DPSC-CMおよび対象としてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（BMMSC）のCM（BMMSC-CM）に含まれる分泌因子を検索するために、サイトカインアッセイにて網羅的解析を行った。次に、ヒト末梢血単球細胞にCMを添加し、フローサイトメトリー（FCM）にてフィトヘマグルチニンで活性化したCD3＋CD25＋T細胞（活性化T細胞）およびCD4＋CD25＋Th細胞（活性化Th細胞）への免疫抑制能を解析した。さらに、一次性SSを引き起こすとされているNon-obese diabetic（NOD）マウスを使用し、CMを1回500µlを静脈内投与（2回/週）し、2週後にマウスの唾液量測定、唾液腺のH&E染色や唾液腺組織を用いた炎症・抗炎症に関わる遺伝子のリアルタイムpolymerase chain reaction（PCR）とタンパク質レベルでの解析を行った。また、脾臓を各Thサブセットマーカー[Th1細胞:T-bet、Th2細胞:GATA3、制御性T細胞（Treg）:Foxp3、Th17細胞:ROR γ]で免疫組織化学染色およびFCMで評価した。さらに、そのメカニズムを解析するため脾臓における各シグナル経路をウエスタンブロットで評価した。

　DPSC-CMは、BMMSC-CMよりも細胞増殖、抗炎症作用、免疫抑制作用に関与する分泌因子が多く含まれていた。FCMでは、DPSC-CM投与群は、他群と比較して活性化T細胞および活性化Th細胞の割合を有意に低下させた。動物実験では、DPSC-CM投与群は、他群と比較して唾液量は有意に多く、唾液腺のH&E染色ではリンパ球浸潤の減少も認められた。リアルタイムPCRにおいては、DPSC-CM投与群は、他群と比較して炎症に関わる遺伝子発現の低下、抗炎症に関わる遺伝子の上昇を認めた。さらに、脾臓におけるThの浸潤はFoxp3陽性細胞が著明に増加しており、ROR γ陽性細胞数は他群と比較して減少していることが分かった。また、脾臓におけるウエスタンブロットにおいては、TGF-β/Smad経路が活性化していることが分かった。

　これらの結果から、DPSC-CMがTGF-β/Smad経路を介して脾臓におけるTreg細胞の分化を促進する一方で、Th17細胞の分化を阻害することによってSSの病態が改善した。よって、DPSC-CMの投与がSSの根治的治療法になりうる可能性が示唆された。

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