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Orthogonal Protein-Responsive mRNA Switches for Mammalian Synthetic Biology

Ono, Hiroki 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23818

2022.03.23

概要

哺乳類細胞を用いた合成生物学分野において、生体高分子を人為的に改変することで遺伝子発現を制御するためのデバイスが開発されてきた。さらには、こうしたデバイスをモジュール式に接続することで人工遺伝子回路を構築し、遺伝子発現のタイミングや強度等を精緻に制御することが可能となる。タンパク質応答型 mRNA スイッチは、mRNA の 5’-UTR に RNA 結合タンパク質(RBP)と相互作用するRNA 配列 (RBP 結合モチーフ)を挿入することで作製できる、 RNA-RBP間結合依存的に翻訳を抑制するデバイスである。このようなRNA を基盤とするデバイスは、転写因子やリコンビナーゼを用いたDNA を基盤とするデバイスと異なり、細胞内に外来DNA を送達する必要がないため、ゲノムの損傷リスクが少なく、安全に外来遺伝子の発現を制御する手法として有用である。しかしながら、翻訳を効率的に制御可能なタンパク質応答型mRNA スイッチの数は限定的であり、それらを組み合わせた人工遺伝子回路の構築を阻む一因となっていた。

本論文では RBP 結合モチーフおよびRBP の改変により、効率的に翻訳を制御可能なタンパク質応答型mRNA スイッチの拡充を試みた。まず、バクテリオファージMS2 由来RBP (MS2CP)と、それに結合するモチーフ (MS2SL) からなるスイッチの改善を試みた。先行研究においてRBP結合モチーフの構造安定性がRBPによる効率的な翻訳抑制に重要であることが示唆されていたことから、本研究ではRNA 構造を安定化できる足場配列にRBP 結合モチーフを挿入することにより翻訳抑制効率の改善を試みた。2 コピーのMS2SL を足場配列に挿入したスイッチは、単に1 コピーまたは2 コピーのMS2SL を挿入したスイッチに比べ、より強い翻訳抑制を示した。加えて、MS2SL と高い親和性を持つ変異体は、野生型に比べ、より効率的に翻訳を抑制できた。次に、RBP結合モチーフを足場配列に挿入する手法を用いて、シュードモナスファージ PP7 由来 RBP(PP7CP) とその結合モチーフ (PP7SL) からなる新たなスイッチの作製を試みた。その結果、PP7SL を足場配列に挿入したスイッチは、1 コピーまたは 2 コピーの PP7SL を挿入したスイッチよりも高い翻訳抑制効率を示した。さらに、ヒトU1A タンパク質に応答するスイッチの改善を試みた。これまでU1A を用いた遺伝子発現制御デバイスでは核局在シグナルを欠く変異体が使用されてきたが、今回野生型のU1A を用いることで、翻訳抑制効率を向上できることを見出した。続いて、タンパク質応答型mRNA スイッチの直交性 (RBP-RBP 結合モチーフ間相互作用の特異性)を確認した。この特性は、遺伝子発現制御デバイスを組み合わせて人工遺伝子回路を構築する際に極めて重要である。今回作製したスイッチ 3 種類と既報のスイッチ 2 種類の直交性を検証したところ、これら 5 種類のスイッチは互いに高い直交性を持つことが示され、 RNA を基盤とする人工遺伝子回路の構築に資することが示唆された。

最後に、今回開発した 3 種類のスイッチが RNA の直接導入でも動作するかを検証した。これまでの一連の実験ではプラスミドベクターを用いて細胞内でスイッチとRBP を発現させており、本スイッチ群が真に DNA を使用せずに駆動するかどうか不明であった。そこで、スイッチおよび RBP をコードする mRNA を試験管内合成し哺乳類細胞に導入したところ、スイッチからの翻訳は対応するRBP の存在下で効率よく抑制された。

本研究で作製したmRNA スイッチは、高い翻訳抑制効率と直交性を示し、RNA の直接導入法を用いても哺乳類細胞内で機能した。したがって、これらのスイッチは翻訳制御を基盤とした人工遺伝子回路の構築・拡張に貢献できる。今後mRNA スイッチやRNA を基盤とした人工遺伝子回路は、細胞療法分野において安全かつ精密な細胞運命制御システムの開発に貢献することが期待される。

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