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Structure-based screening combined with computational and biochemical analyses identified the inhibitor targeting the binding of DNA Ligase 1 to UHRF1

郡 聡実 横浜市立大学

2022.03.25

概要

1. 序
エピジェネティック変異は細胞のがん化の要因の一つであり、ゲノムの不安定化やがん抑制遺伝子の発現抑制を引き起こす 1,2。エピジェネティック修飾の一つである DNA メチル化*a は、細胞固有の遺伝子発現パターンを規定し、ゲノムインプリンティングや X 染色体の不活性化などに関与する 3。一方で、がん細胞では異常な DNA メチル化パターンがみられることから 4,5、DNA メチル化の制御因子はがん創薬の標的分子として注目されている。

哺乳類の DNA メチル化は、主に CG 配列中のシトシン塩基の 5 位の炭素に起こり、ヘテロクロマチン構造の形成を促すことで遺伝子発現の抑制に関与する。重要なことに、一度確立した DNA メチル化パターンは個体の生涯にわたって正確に維持される(DNA 維持メチル化)。DNA 維持メチル化には、DNA メチル化酵素 DNMT1 とそのリクルーターである UHRF1*b が必須の因子として働き、複製非共役型・共役型の異なる 2 つの分子機構が明らかとなっている (図 1)6–8。DNA 複製後、DNA メチル化の情報は受け継がれないため、親鎖のみがメチル化された片鎖メチル化 DNA が一過的に生じる。複製非共役型の DNA 維持メチル化では、UHRF1 が片鎖メチル化 DNA を認識し 9–11、近傍のヒストン H3 をユビキチン化する 12,13。このユビキチン化ヒストン H3 が DNMT1 を片鎖メチル化 DNA へと呼び込むシグナルとなり、新生鎖がメチル化される 13–15。複製共役型の DNA 維持メチル化では、Lys126 がトリメチル化された DNA ligase1 (LIG1)*c によって UHRF1 が複製部位へ呼び込まれる (Ferry et al., 2017, Kori et al., 2019)。その後、UHRF1 は複製因子 PAF15 をユビキチン化し 16,17、ユビキチン化 PAF15 によって DNMT1 が複製部位へ呼び込まれ新生鎖がメチル化される (Nishiyama et al., 2020)。また、複製後 30分以内に CG 配列の約 80%の維持メチル化が完了することから、複製共役型の維持メチル化がその大半を担っていることが報告されている 7。

このように UHRF1 は DNA 維持メチル化の必須因子として働くが、その一方で UHRF1 は様々ながん細胞で高発現し、DNA メチル化異常を引き起こすことが報告されている 18。さらに、がん細胞中の UHRF1 のノックダウンはがん抑制遺伝子の発現を回復させることから 19–23、過剰発現した UHRF1 の機能阻害剤はがんの治療薬になる と考えられている。UHRF1 を標的とした阻害剤開発はすでに数例の報告があるものの、どれも実用化には至っていないのが現状である。

申請者は、複製共役型のDNA 維持メチル化機構の構造生物学的な解明のため、UHRF1 の TTD ドメインと LIG1K126me3 の複合体の X 線結晶構造解析*d を行った。この結晶構造から、LIG1 のトリメチル化リジンは TTD の aromatic cage で認識されることを明らかにした。これに加えて、Arg-binding cavity と名付けた結合溝で LIG1R121 を認識する ことが TTD と LIG1 の結合に重要であることを明らかにした (図 2)。UHRF1 と LIG1の結合は複製共役型の維持メチル化の初期に形成されることから、この結合阻害はがん細胞中で高発現した UHRF1 の機能阻害につながると考えた。そこで本研究では、 TTD の Arg-binding cavity を標的とし、LIG1 との結合を阻害する UHRF1 の機能阻害剤の開発を目的とした。

2. 実験方法
1) In silico スクリーニングによる候補化合物の選抜
生命情報科学研究室との共同研究で、約 20 万個の化合物を含むライブラリから阻害剤探索を行った。化合物を分子量で 3 つに分類し、ドッキングシミュレーションによる静的な指標で化合物を選抜した。このうち、スコアが上位の化合物については水分子を含めた全原子分子動力学 (MD) シミュレーションを行い、動的な指標 (構造揺らぎ)も考慮した。また、MD シミュレーション中で TTD の Arg-binding cavity と化合物の間に形成された相互作用を抽出し、その種類や頻度を反映させた動的ファーマコフォアモデル*e を作成した。このモデルに該当する化合物をライブラリからさらに選出した。

2) 熱安定性実験による化合物存在下での TTD の熱安定性の評価
In silico スクリーニングで選抜した候補化合物が、実際に TTD と結合できるかを検証するために、化合物存在下での TTD の熱安定性実験を行った。TTD と 130 種類の化合物をそれぞれ混合し、25 ºC から 90 ºC まで温度を上昇させ、タンパク質の変性温度を調べた。TTD ドメイン単体 (apo-TTD) の変性温度 (Tm) と比較し、化合物存在下での TTD の変性温度の差 (ΔTm) を算出し評価した。

3) TTD と 5-amino-2,4-dimethylpyridine (5A-DMP) の相互作用解析
熱安定性実験で TTD の変性温度を最も上昇させた 5A-DMP と TTD の結合を定量的に見積もるために、等温滴定型カロリメトリー (ITC)*f 測定を行った。得られたデータから解離定数を算出した。

4) TTD と 5A-DMP の複合体の X 線結晶構造解析
TTD による 5A-DMP の認識様式を明らかにするために、X 線結晶構造解析を行った。 41 mg/ml の TTD に 10 等量の 5A-DMP 混合し、共結晶化を行った。得られた結晶の回折強度データは放射光施設 Photon Factory (PF) BL-5A で得た。位相決定は apo-TTD の結晶構造 (PDB: 5YYA) をサーチモデルに分子置換法で行い、複合体構造を決定した。

5) ペプチド解離実験による 5A-DMP の阻害効果の検証
TTD に対する 5A-DMP の阻害活性を検証するために、蛍光偏光解消法に基づいたペプチド解離実験を行った。N 末端を 6-carboxyfluorescein hydrate (FAM) でラベルした LIG1118-130K126me3 または C 末端を FAM ラベル化した H31-15K9me3 と TTD を混合し、5A-DMP を滴定した。ペプチドに付加した FAM の蛍光偏光の解消を検出することで、5A-DMP の添加による TTD からのペプチドの解離を評価した。

6) 全長タンパク質に対する 5A-DMP の阻害効果の検証
全長 UHRF1 に対する 5A-DMP の阻害活性を検証するために、東京大学 癌防御シグナル分野との共同研究でアフリカツメガエルの卵抽出液による無細胞系での阻害実験を行った。卵抽出液から抗 LIG1 抗体で LIG1 を免疫沈降し、共沈する UHRF1を検出することで、5A-DMP の添加による UHRF1 と LIG1 の結合阻害を評価した。

3. 研究結果
1) 化合物ライブラリからの 130 個の候補化合物の選別
分子量ごとに 3 つに分類した化合物を、ドッキングシミュレーションでそれぞれ 1000 個ずつ選抜した。さらに静的な指標を基に 44 個の化合物を選抜した。このうち、上位 34個の化合物については MD シミュレーションで動的な指標も考慮した。さらに、同時に実施した動的ファーマコフォアスクリーニングで 86 個の化合物を選出した。計 130 個の候補化合物を in silico スクリーニングで選抜し
た。

2) TTD に結合する化合物の同定
熱安定性実験の結果、apo-TTD の Tm 値は 46.5 ºC だった。in silico スクリーニングで選抜した 130種類の化合物とTTD を混合した結果、2 種類の化合物 (CID 1, CID 2) が TTD の変性温度を上昇させた (図 3)。この 2 つの化合物は MD シミュレーション中でも結合ポーズが安定だった。そのうち、TTD の熱安定性を最も向上させた 5A-DMP (CID 1) は、TTD と KD = 19.3 µM で結合することを ITC 測定で明らかにした。

3) TTD による 5A-DMP の認識様式の解明
1.45 Å 分解能で複合体構造の決定に成功し、5A-DMP の電子密度が TTD の Arg-binding cavity に存在することを確認した ( 図 4)。立体構造情報に基づき、 5A-DMP の認識に関与するアミノ酸残基をアラニン残基に置換した変異体を作製した。これらの変異体を用いた ITC 測定の結果、D142A, E153A, W238A 変異体は 5A-DMP との結合を示さなかった。M224A, F278A 変異体は 5A-DMP との結合は示 したものの、正確な解離定数を見積もれないほどの弱い結合だった (図 5)。以上のこ とから、5A-DMP はTTD のArg-binding cavity で特異的に認識されることが分かった。

4) 5A-DMP の阻害効果の検証
ペプチド解離実験の結果、5A-DMP の濃度依存的に LIG1K126me3 や H3K9me3 に付加した FAM の蛍光偏光の解消が起こった。したがって、5A-DMP は TTD に結合した LIG1K126me3 または H3K9me3 を解離させることを明らかにした (図 6)。さらに、アフリカツメガエルの卵抽出液を用いた免疫沈降実験で、5A-DMP の濃度依存的に LIG1 の免疫沈降画分から検出した UHRF1 のバンドが薄くなった。このことから、 5A-DMP は全長 UHRF1 と LIG1 の結合も阻害できることを明らかにした (図 7)。

4. 討論
・ 複数の指標を考慮した in silico スクリーニングで TTD の Arg-binding cavity に結合する阻害剤探索を行った。実験的な検証と照らし合わせた結果、MD シミュレーションで選抜した化合物群が最もヒット率が良く、MD シミュレーションがスクリーニングに有用であることが示唆された。これは他の標的タンパク質に対する阻害剤探索においても適用できると考える。

・ X 線結晶構造解析や MD シミュレーションから、5A-DMP のほぼすべての原子が TTD の Arg-binding cavity で認識されており、その ligand efficiency が非常に高いことが分かった。ITC 測定で、TTD の Arg-binding cavity 内の 1 つのアミノ酸の変異だけで 5A-DMP との結合が著しく弱くなったことからも、その認識の特異性が示された。

・ TTD とLIG1K126me3 の結合には、トリメチル化リジンを認識するTTD のaromatic cage と LIG1R121 を認識する TTD の Arg-binding cavity が重要である。aromatic cage は結合特異性を、Arg-binding cavity は結合親和性を決定する重要な相互作用領域である。本研究で同定した 5A-DMP は、Arg-binding cavity への LIG1R121 の結合を阻害することで、UHRF1 と LIG1 の結合を阻害したと考える。

・ 5A-DMP はアフリカツメガエルの卵抽出液中で全長レベルの UHRF1 と LIG1 の結合阻害を示した。しかし、TTD と LIG1K126me3 は KD = 9.1 nM で結合するのに対し、5A-DMP は KD = 19.3 µM であり、その親和性は非常に弱い。したがって、 UHRF1 の機能阻害剤の開発には 5A-DMP をリード化合物としたさらなる構造展開が必要である。TTD と LIG1K126me3 の複合体の結晶構造から、TTD は Arg-binding cavity だ け で な く 、 LIG1T123 を 認 識 す る 小 さ な 窪 み や 、 LIG1K126me3 を認識する aromatic cage といった相互作用部位を持つことが分かった。そこで、Arg-binding cavity と同時にこれらの相互作用部位に結合する化合物は、より活性の高い UHRF1 阻害剤として作用すると考える。

・ 5A-DMP をリード化合物とした構造最適化には、溶媒領域に露出した 5A-DMPのピリジニウムの 4 位のメチル基からの構造展開が最適であると考える。さらに、この構造展開においても、本研究で実施したMD シミュレーションによるスクリーニングと構造生物学による検証が有効であると考える。

5. まとめ
1) in silico スクリーニングでライブラリ中の 20 万化合物から 130 個の候補化合物を選抜し、スクリーニングの効率化に成功した。
2) 熱安定性実験により、TTD に結合する化合物を 2 種類同定した。5A-DMP は TTD の変性温度を最も上昇させた。
3) ITC 測定の結果、TTD と 5A-DMP は KD = 19.3 µM で結合することが分かった。
4) TTD と 5A-DMP の複合体の X 線結晶構造解析を行い、1.45 Å 分解能で立体構造の決定に成功した。5A-DMP は TTD の Arg-binding cavity に結合することを明らかにした。
5) ペプチド解離実験により、5A-DMP は TTD と LIG1K126me3 または H3K9me3 の結合を阻害することを明らかにした。
6) アフリカツメガエルの卵抽出液を用いた免疫沈降実験から、5A-DMP は全長 UHRF1 と LIG1 の結合も阻害できることを明らかにした。

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参考文献

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