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テルペン合成酵素に関する研究

三橋, 隆章 東京大学 DOI:10.15083/0002004443

2022.06.22

概要

【研究の背景・⽬的】
天然由来の化合物の中には、医薬品をはじめ、機能性⾷品、⾹料、⼯業原料として有⽤とされるものが数多く存在する。こうした天然由来化合物の中において、テルペノイドは、最も構造多様性に富む化合物群の⼀つとして知られている。

テルペノイドは⽣体内において、ジメチルアリル⼆リン酸(DMAPP)及びイソペンテニル⼆リン酸(IPP)から合成される。具体的には、先ずDMAPP及びIPPが縮合し、鎖状のポリプレニル⼆リン酸が合成される。次に、ポリプレニル⼆リン酸が環化を受けることによってテルペノイドの基本的な炭素⾻格が形成される。環化反応を担う酵素に応じて、様々な炭素⾻格が形成されることで、テルペノイドの構造多様性が⽣み出される。また炭素⾻格の形成後、場合により修飾酵素による変換を受け、多様性は更に拡⼤される。

遺伝⼦解析技術の発展を背景に、テルペノイドの⽣合成に関わる酵素をコードすると推定される遺伝⼦を遺伝情報中から探索することは、近年、容易になりつつある。また、実際に公開されている遺伝⼦データベース上にも、そのような遺伝⼦を数多く⾒出だすことができる。しかし現状では、こうした遺伝⼦の多くは未解析のまま残されている。その⼀因として、酵素産物の構造決定の難しさが挙げられる。特に、テルペノイドに関しては、多数の不⻫中⼼と環構造を持つ例が数多く知られており、構造決定は特に困難である。

しかし、複雑かつ多様な構造を創出する酵素こそ、機能解析する価値があると考え、本研究では特にテルペノイドの炭素⾻格形成に関わる酵素に着⽬し、その機能解析を⾏った。

【結果・考察】
１.Cyclopiane型ジテルペノイドの炭素⾻格形成を担う酵素の同定1
⽷状菌Penicillium chrysogenum MT-12のゲノム情報を解析した際、テルペノイドの炭素⾻格形成に関わると推定される遺伝⼦を⾒出だした。本遺伝⼦に類似の遺伝⼦を検索したところ、他のPenicillium属⽷状菌のゲノム情報中にも類似性の⾼い遺伝⼦が⾒出だされた。このことから、本遺伝⼦がコードする酵素の機能に興味を持ち、機能解析を⾏った。

解析にあたっては、解析対象となる遺伝⼦を⽷状菌Aspergillus oryzaeに導⼊する⼿法を⽤いた。導⼊した遺伝⼦が強制発現する条件にて、A.oryzae形質転換体を培養後、菌体抽出物から酵素産物を精製した。

しかし、酵素産物の精製後にNMR測定を⾏ったところ、シグナルのブロードニングが観測され、NMR解析による構造決定が困難であると判明した。本化合物は油状物質であり、解析対象の結晶化を必要とする単結晶X線構造解析も困難であると考えられた為、結晶スポンジ法による解析を試みた。結晶スポンジ法とは、細孔性の⾦属錯体結晶の内部に解析対象化合物を導⼊することで、対象化合物を規則正しく整列させ、対象を結晶化することなくX線結晶構造解析を⾏う⼿法である。結果、酵素産物の構造を観測することができ、構造決定に⾄った。

酵素産物は6-5-5-5員環構造を持つ化合物１であった（図１）。１の炭素⾻格はcyclopiane型ジテルペノイドとして知られる⼀連の化合物に⾒られる炭素⾻格と同⼀のものであった。従って、本酵素をPcCS（Penicilliumchrysogenum Cyclopiane-typediterpene Synthase）と名付けた。また、ジテルペノイドとは、特に炭素数20のポリプレニル⼆リン酸であるゲラニルゲラニル⼆リン酸(GGPP)を経て⽣合成されるテルペノイドを指す。PcCSがGGPPから１を形成する際の反応機構を図２のように推定した。

1が酸化などの更なる修飾を受けたcyclopiane型ジテルペノイドは10種類以上が既に知られているが、それらの前駆体と推定される1が天然から単離報告された例は、これまで無かった。

また、計算化学の⼿法を⽤い、１の配座を解析したところ、特に6員環部分においてコンフォメーションが変化しやすいことが⽰唆された。従って、1のNMRシグナルのブロードニングは、溶液中におけるコンフォメーション変化に起因すると推察される。

２.新規炭素⾻格を有するセスタテルペンastellifadiene(2)を合成する酵素の発⾒と解析2
セスタテルペノイドとは、炭素数25のポリプレニル⼆リン酸であるゲラニルファルネシル⼆リン酸（GFPP）から⽣合成されるテルペノイドを指す。本化合物群は天然において、⽐較的稀なテルペノイドとして知られており、⽣合成についての知⾒も限られていた。

⽷状菌Emericellavariecolor NBRC32302のゲノム情報中を検索したところ、テルペン合成酵素をコードすると推定される遺伝⼦を⾒出だした為、PcCSの解析と同様に、⽷状菌A.oryzaeに導⼊し、強制発現させる⼿法を⽤い、機能解析を⾏った。酵素産物を精製後、質量分析、NMR、結晶スポンジ法を⽤いて構造解析したところ、6-8-6-5員環構造を持つ新規セスタテルペンであると判明した。そこで、酵素産物をastellifadiene(2)と名付け（図３）、2を合成する酵素をEvAS（Emericellavariecolor Astellifadiene Synthase）とした。更に、２と同様の炭素⾻格を持つ化合物はこれまでに報告例が無く、EvASは新規炭素⾻格を形成する酵素であった。安定同位体を⽤いた標識実験の結果より、GFPPから２が⽣成する機構について推定した（図３）。

【総括】
本研究を通じて、新規のテルペン合成酵素の機能を明らかにすることができた。また、１および２は両者ともに、天然からの単離報告が無い化合物であり、未解析酵素の機能解析を通して、新規化合物の取得も同時に⽬指すことができると⽰した。今後、更に多くのテルペン合成酵素の解析が進むことで、これら酵素が触媒する複雑な環化反応を制御するためのメカニズムが、詳細に明らかになることが期待される。

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