リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

大学・研究所にある論文を検索できる 「ヒトiPS細胞由来内胚葉前駆細胞の分離取得と肝分化誘導への応用」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。
リケラボ

コピーが完了しました

URLをコピーしました

論文の公開元へ論文の公開元へ
書き出し

ヒトiPS細胞由来内胚葉前駆細胞の分離取得と肝分化誘導への応用

松下, 沙希子 MATSUSHITA, Sakiko マツシタ, サキコ 九州大学

2022.03.23

概要

肝臓は再生能力・代謝能力に優れた生体内で最大の臓器であり、合成、解毒、貯蔵などその働きは多岐にわたる。このような肝臓の機能を人工的な装置で全て補うことは中長期的にみても極めて困難であり、重篤な肝不全患者に対して現状では有用な治療法とされているのは肝移植のみである。そこで近年注目されている治療法として肝再生医療が挙げられる。肝再生医療の実現には臨床用細胞源の確保が最重要課題である。本来ならば、標的となる臓器・組織を構成する細胞を用いることが好ましいが、肝細胞に代表されるように、ドナーが不足する、あるいは増殖能に乏しい場合、大量供給が困難である。そこで、これらの問題を回避できる新たな細胞として、人工多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cells：iPS 細胞）が注目されている。患者自身から樹立した iPS 細胞を細胞源として使用することができれば、拒絶反応の無い移植用組織や臓器の作製が可能になると期待されており、再生医療の更なる発展に向けて注目が集まっている。

本研究では、肝再生医療の細胞源を確保する手段としてヒト iPS 細胞に着目し、iPS から分化誘導された肝細胞を大量に取得可能な新規培養プロセスの確立を目的とした。まず、大量培養へと応用可能な培養法として、半透性の膜から構成される中空糸の内腔を培養空間として、そこで iPS 細胞の三次元培養を行うことに着目した。次に、iPS 細胞から肝細胞への分化誘導について、現在、様々な肝分化誘導法が報告されているが、その分化誘導効率は必ずしも 100%ではない。この場合、分化誘導率を高めるか、目的以外の細胞を除去することが必要となる。そこで、本研究では中空糸を用いた独自の三次元培養法により iPS 細胞を培養する過程において、まずは未分化状態で高密度培養を達成し、その後分化誘導を行い、肝細胞へと運命付けられた細胞集団を分離取得し、その細胞集団を成熟化させる多段階の培養プロセスの有効性について検討した。さらに、iPS 細胞が中空糸内部で形成する細胞凝集塊の形状が iPS 細胞の運命決定因子として作用する可能性に着目し、中空糸径による iPS 細胞の分化傾向について検討を行うことにより、iPS 細胞の分化誘導法としての中空糸培養の有効性の評価に取り組んだ。

第 1 章では、本研究の目的・背景を述べるとともに、本研究の目的及び目的達成のための研究方針を示した。また、本研究のオリジナリティを示し、本研究の位置付けを明確にした。第 2 章では、本研究の標的臓器である肝臓について概説し、肝再生医療の現状を示した。さらに、肝再生医療の細胞源となり得る細胞について示し、本研究で細胞源候補として着目した多能性幹細胞から肝細胞への分化誘導の既往の研究について示した。また、多能性幹細胞の大量培養法についての既往の研究についても示した。

第 3 章では、中空糸培養法を用いてヒト iPS 細胞の三次元培養を実施するとともに、肝細胞への自発的分化誘導過程における内胚葉系細胞の分離取得を行った。ヒト iPS 細胞は中空糸内で良好に増殖し、高密度培養の達成が可能であった。また自発的分化誘導過程における目的細胞の分離取得のためのマーカーとして内胚葉マーカーである CXCR4 を選択し、培養過程における CXCR4 の発現の推移を評価するとともに、従来法である単層培養法との比較を行った。その結果、高密度条件下にもかかわらず従来法である単層培養と比較して約 2 倍の分化誘導率が示された。さらに、培養過程における特異的細胞集団の分離取得として、磁気細胞分離法に着目し、CXCR4 をマーカーとした磁気細胞分離を実施することにより CXCR4 発現細胞の分離取得とその特性評価を行った。第 4 章では、分化誘導過程における iPS 細胞の運命決定因子として、iPS 細胞が形成する凝集塊の径に着目し、内径の異なる 2 種類の中空糸（φ145μm、φ366μm）を用いてヒト iPS 細胞の自発的な分化培養を行い、分化傾向の違いを評価した。この結果、φ366µm では内胚葉・中胚葉へ、φ145µm では外胚葉へと分化しやすい傾向を見出した。従って、中空糸の内径が内部で形成されるヒト iPS 細胞凝集塊の分化傾向に影響を及ぼすことが示唆された。さらに、中空糸径による分化傾向の違いを利用して、ヒト iPS 細胞の肝分化培養を行った。

第 5 章では、本論文の総括を行うとともに、本研究の成果を基に今後の課題と展望について述べた。

論文の公開元へ

この論文で使われている画像

関連論文

関連論文をもっと見る

参考文献

1. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126(4): 663-76. 2006.

2. 渥美和彦. 人工臓器不老不死の時代は来るか. 東京書籍. 1990.

3. 中井益代, 山本三毅夫, 山本直樹, 坂井建雄. Imidas Special Issue 人体とウイルス. 集英社.1996.

4. 酒井清孝. 人工臓器(2)代謝系人工臓器. (株)コロナ社. 2003.

5. 水野美淳, 田代仁正, 大河原久子. 肝臓と膵臓のはなし. (株)培風館. 1990.

6. Novikoff, A.B, Cell heterogeneity within the hepatic lobule of the rat: staining reactions, J Histochem Cytochem, 7(4): 240-244. 1959.

7. 内田俊和. 最新肝臓病理学. 羊土社. 1999.

8. 織田敏次. 肝臓の生物学. 東京大学出版. 1990.

9. 福田 晃也, 柳 佑典, 清水 誠一, 内田 孟, 阪本 靖介, 中村 和昭, 梅澤 明弘, 堀川 玲子, 笠原群生. 尿素サイクル異常症に対するヒトES 細胞由来肝細胞移植. 移植 55(総会臨時): 226-226. 2020.

10. Poyck PP, Hoekstra R, van Wijk AC, Attanasio C, et al. Functional and Morphological Comparison of Three Primary Liver Cell Types Cultured in the AMC Bioartificial Liver. LIVER TRANSPLANTATION. 13: 589-598. 2007.

11. Doi I. Establishment of a cell line and its clonal sublines from a patient with hepatoblastoma. Gann.67:1-10. 1976.

12. Nyberg SL, Remmel RP, Mann HJ, Peshwa MV, et al. Primary hepatocytes outperform Hep G2 cells as the source of biotransformation functions in a bioartificial liver. Ann Surg.220:59-67. 1994.

13. Kobayashi N, Fujiwara T, Westerman KA, Inoue Y, et al. Prevention of acute liver failure in rats with reversibly immortalized human hepatocytes. Science. 287(5456): 1258-62. 2000.

14. Totsugawa T, Yong C, Rivas-Carrillo JD, Soto-Gutierrez A, et al. Survival of liver failure pigs by transplantation of reversibly immortalized human hepatocytes with Tamoxifen-mediated self- recombination. J Hepatol. 47(1): 74-82. 2007.

15. Li J, Li LJ, Cao HC, Sheng GP, et al. Establishment of highly differentiated immortalized human hepatocyte line with simian virus 40 large tumor antigen for liver based cell therapy. ASAIO J. 51(3): 262-8. 2005.

16. Schippers IJ, Moshage H, Roelofsen H, Müller M, et al. Immortalized human hepatocytes as a tool for the study of hepatocytic (de-) differentiation. Cell Biol Toxicol. 13(4-5): 375-86. 1997.

17. Werner A, Duvar S, Müthing J, Büntemeyer H, et al. Cultivation and characterization of a new immortalized human hepatocyte cell line, HepZ, for use in an artificial liver support system. Ann N Y Acad Sci. 875: 364-368. 1999

18. Okitsu T, Kobayashi N, Jun HS, Shin S, et al. Transplantation of reversibly immortalized insulin- secreting human hepatocytes controls diabetes in pancreatectomized pigs. Diabetes. 53:105-12. 2004.

19. Kobayashi N, Okitsu T, Tanaka. Cell choice for bioartificial livers. Keio J Med. 52(3): 151-157. 2003.

20. Schmelzer E, Wauthier E, Reid LM. The phenotypes of pluripotent human hepatic progenitors. Stem Cells.24:1852-8. 2006.

21. Asahina K, Fujimori H, Shimizu-Saito K, Kumashiro Y, Okamura K, Tanaka Y, et al. Expression of the liver-specific gene Cyp7a1 reveals hepatic differentiation in embryoid bodies derived from mouse embryonic stem cells. Genes Cells.9:1297-308. 2004.

22. Alison MR, Golding MH, Sarraf CE. Pluripotential liver stem cells: facultative stem cells located in the biliary tree. Cell Prolif.29:373-402. 1996.

23. Forbes SJ, Vig P, Poulsom R, Wright NA, Alison MR. Adult stem cell plasticity: new pathways of tissue regeneration become visible. Clin Sci (Lond).103:355-69. 2002.

24. Vessey CJ, de la Hall PM. Hepatic stem cells: a review. Pathology.33:130-41. 2001.

25. Omori M, Evarts RP, Omori N, Hu Z, Marsden ER, Thorgeirsson SS. Expression of alpha- fetoprotein and stem cell factor/c-kit system in bile duct ligated young rats. Hepatology.25:1115-22. 1997.

26. Petersen BE, Goff JP, Greenberger JS, Michalopoulos GK. Hepatic oval cells express the hematopoietic stem cell marker Thy-1 in the rat. Hepatology.27:433-45. 1998.

27. Shimano K, Satake M, Okaya A, Kitanaka J, Kitanaka N, Takemura M, et al. Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1. Am J Pathol.163:3-9. 2003.

28. He ZP, Tan WQ, Tang YF, Zhang HJ, Feng MF. Activation, isolation, identification and in vitro proliferation of oval cells from adult rat livers. Cell Prolif.37:177-87. 2004.

29. Tanimizu N, Nishikawa M, Saito H, Tsujimura T, Miyajima A. Isolation of hepatoblasts based on the expression of Dlk/Pref-1. J Cell Sci.116:1775-86. 2003.

30. Zhang L, Theise N, Chua M, Reid LM. The stem cell niche of human livers: symmetry between development and regeneration. Hepatology.48:1598-607. 2008.

31. Shiojiri N, Lemire JM, Fausto N. Cell lineages and oval cell progenitors in rat liver development. Cancer Res.51:2611-20. 1991.

32. Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature.292:154-6. 1981.

33. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science.282:1145-7. 1998.

34. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell.131:861-72. 2007.

35. Dimos JT, Rodolfa KT, Niakan KK, Weisenthal LM, Mitsumoto H, Chung W, et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science.321:1218-21. 2008.

36. Hanna J, Wernig M, Markoulaki S, Sun CW, Meissner A, Cassady JP, et al. Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin. Science.318:1920-3. 2007.

37. Zhang J, Wilson GF, Soerens AG, Koonce CH, Yu J, Palecek SP, et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circ Res.104:e30-41. 2009.

38. Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science.322:949-53. 2008.

39. Kim D, Kim CH, Moon JI, Chung YG, Chang MY, Han BS, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell.4:472-6. 2009.

40. Abe K, Niwa H, Iwase K, Takiguchi M, et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Exp Cell Res. 229:27-34. 1996.

41. Levinson-Dushnik M, Benvenisty N. Involvement of hepatocyte nuclear factor 3 in endoderm differentiation of embryonic stem cells. Mol Cell Biol. 17:3817-22. 1997.

42. Desbaillets I, Ziegler U, Groscurth P, Gassmann M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol.85:645-51. 2000.

43. Yamada T, Yoshikawa M, Kanda S, Kato Y, Nakajima Y, Ishizaka S, et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into hepatocyte-like cells identified by cellular uptake of indocyanine green. Stem Cells.20:146-54. 2002.

44. Kumashiro Y, Asahina K, Ozeki R, Shimizu-Saito K, Tanaka Y, Kida Y, et al. Enrichment of hepatocytes differentiated from mouse embryonic stem cells as a transplantable source. Transplantation.79:550-7. 2005.

45. Hamazaki T, Iiboshi Y, Oka M, Papst PJ, Meacham AM, Zon LI, et al. Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cells in vitro. FEBS Lett.497:15-9. 2001.

46. Hu AB, Cai JY, Zheng QC, He XQ, Shan Y, Pan YL, et al. High-ratio differentiation of embryonic stem cells into hepatocytes in vitro. Liver Int.24:237-45. 2004.

47. Jochheim A, Hillemann T, Kania G, Scharf J, Attaran M, Manns MP, et al. Quantitative gene expression profiling reveals a fetal hepatic phenotype of murine ES-derived hepatocytes. Int J Dev Biol.48:23-9. 2004.

48. Shirahashi H, Wu J, Yamamoto N, Catana A, Wege H, Wager B, et al. Differentiation of human and mouse embryonic stem cells along a hepatocyte lineage. Cell Transplant.13:197-211. 2004.

49. Zaret KS, Grompe M. Generation and regeneration of cells of the liver and pancreas.Science.322:1490-4. 2008.

50. Calmont A, Wandzioch E, Tremblay KD, Minowada G, Kaestner KH, Martin GR, et al. An FGF response pathway that mediates hepatic gene induction in embryonic endoderm cells. Dev Cell.11:339-48. 2006.

51. Serls AE, Doherty S, Parvatiyar P, Wells JM, Deutsch GH. Different thresholds of fibroblast growth factors pattern the ventral foregut into liver and lung. Development.132:35-47. 2005.

52. Huang H, Ruan H, Aw MY, Hussain A, Guo L, Gao C, et al. Mypt1-mediated spatial positioning of Bmp2-producing cells is essential for liver organogenesis. Development.135:3209-18. 2008.

53. Si-Tayeb K, Lemaigre FP, Duncan SA. Organogenesis and development of the liver. Dev Cell.18:175-89. 2010.

54. Snykers S, De Kock J, Rogiers V, Vanhaecke T. In vitro differentiation of embryonic and adult stem cells into hepatocytes: state of the art. Stem Cells.27:577-605. 2009.

55. Kubo A, Shinozaki K, Shannon JM, Kouskoff V, Kennedy M, Woo S, et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development.131:1651-62. 2004.

56. Xin Cheng, Lei Ying, Lin Lu, Aline M. Galvão, Jason A. Mills, Henry C, et al. Self-Renewing Endodermal Progenitor Lines Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell.10 (4):371-84.2012.

57. Ishizaka S, Shiroi A, Kanda S, Yoshikawa M, Tsujinoue H, Kuriyama S, et al. Development of hepatocytes from ES cells after transfection with the HNF-3beta gene. FASEB J.16:1444-6. 2002.

58. Takayama K, Inamura M, Kawabata K, Katayama K, Higuchi M, Tashiro K, et al. Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction. Mol Ther.20:127-37. 2012.

59. Takayama K, Inamura M, Kawabata K, Sugawara M, Kikuchi K, Higuchi M, et al. Generation of metabolically functioning hepatocytes from human pluripotent stem cells by FOXA2 and HNF1alpha transduction. J Hepatol.57:628-36. 2012.

60. Rambhatla L, Chiu CP, Kundu P, Peng Y, Carpenter MK. Generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells. Cell Transplant.12:1-11. 2003.

61. Basma H, Soto-Gutierrez A, Yannam GR, Liu L, Ito R, Yamamoto T, et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology.136:990-9. 2009.

62. Hay DC, Fletcher J, Payne C, Terrace JD, Gallagher RC, Snoeys J, et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proc Natl Acad Sci U S A.105:12301-6. 2008.

63. Hay DC, Zhao D, Fletcher J, Hewitt ZA, McLean D, Urruticoechea-Uriguen A, et al. Efficient differentiation of hepatocytes from human embryonic stem cells exhibiting markers recapitulating liver development in vivo. Stem Cells.26:894-902. 2008.

64. Dziadek M, Adamson E. Localization and synthesis of alphafoetoprotein in post-implantation mouse embryos. J Embryol Exp Morph. 43:289–313. 1978

65. Meehan RR., Barlow DP, Hill RE., Hogan BLM, Hastie N.D. Pattern of serum protein gene expression in mouse visceral yolk sac and foetal liver. EMBO J. 3:1881–1885. 1984

66. Sellem CH., Frain M., Erdos T, Sala-Trepat JM. Differential expression of albumin and α- fetoprotein genes in fetal tissues of mouse and rat. Dev Biol. 102:51–60. 1984.

67. Duncan SA., Nagy A, Chan W. Murine gastrulation requires HNF-4 regulated gene expression in the visceral endoderm: tetraploid rescue of Hnf-4−/– embryos. Development. 124:279–287. 1997

68. Cormier JT, zur Nieden NI, Rancourt DE, Kallos MS. Expansion of undifferentiated murine embryonic stem cells as aggregates in suspension culture bioreactors. Tissue Eng.12:3233-45. 2006.

69. Krawetz R, Taiani JT, Liu S, Meng G, Li X, Kallos MS, et al. Large-scale expansion of pluripotent human embryonic stem cells in stirred-suspension bioreactors. Tissue Eng Part C Methods.16:573-82. 2010.

70. Amit M, Chebath J, Margulets V, Laevsky I, Miropolsky Y, Shariki K, et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev.6:248-59. 2010.

71. Serra M, Correia C, Malpique R, Brito C, Jensen J, Bjorquist P, et al. Microencapsulation technology: a powerful tool for integrating expansion and cryopreservation of human embryonic stem cells. PLoS One.6:e23212. 2011.

72. Paccola Mesquita FC, Hochman-Mendez C, Morrissey J, Sampaio LC, Taylor D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells Int. 2019: Article ID 9704945. 2019

73. Oh SK, Fong WJ, Teo Y, Tan HL, Padmanabhan J, Chin AC, et al. High density cultures of embryonic stem cells. Biotechnol Bioeng. 91:523-33. 2005.

74. Matsuura K, Wada M, Shimizu T, Haraguchi Y, Sato F, et al. Creation of human cardiac cell sheets using pluripotent stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 425:321-327. 2012.

75. Matsuura K, Masuda S, Shimizu T. Cell Sheet-Based Cardiac Tissue Engineering, Anat. Rec. (Hoboken). 297:65-72. 2014.

76. Mizumoto H, Ishihara K, Nakazawa K, Ijima H, Funatsu K, Kajiwara T. A new culture technique for hepatocyte organoid formation and long-term maintenance of liver-specific functions. Tissue Eng Part C Methods.14:167-75. 2008.

77. Amimoto N, Mizumoto H, Nakazawa K, Ijima H, Funatsu K, Kajiwara T. Hepatic Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells During Organoid Formation in Hollow Fibers. Tissue Engineering Part A. 17(15-16): 831-839, 2011.

78. Ohgushi M, Matsumura M, Eiraku M, Murakami K, et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7(2):225-239. 2010.

79. Otsuji TG, Bin J, Yoshimura A, Tomura M, Tateyama D, et al. A 3D sphere culture system containing functional polymers for large-scale human pluripotent stem cell production. Stem Cell Rep, 2: 734-745. 2014.

80. Van Winkle AP, Gates I., Kallos MS. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells Tissues Organs. 196:34-47. 2012.

81. Sepulveda DE, Andrews BA., Asenjo JA., Papoutsakis ET. Comparative transcriptional analysis of embryoid body versus twodimensional differentiation of murine embryonic stem cells. Tissue Eng. Part A. 14:1603-1614. 2008.

82. Kim MH, Kino-oka M. Maintenance of an undifferentiated state of human induced pluripotent stem cells through migration-dependent regulation of the balance between cell-cell and cell- substrate interactions. J. Biosci. Bioeng. 119: 617-622. 2015.

83. Kim MH, Kino-oka M. Switching between self-renewal and lineage commitment of human induced pluripotent stem cells via cell-substrate and cell-cell interactions on a dendrimer- immobilized surface. Biomaterials. 35:5670-5678. 2014.

84. Davenport C, Diekmann U, Naujok O. A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells. J Vis Exp. 109:53655. 2016

85. Moon SH, Ju J, Park SJ, Bae D, Chung HM, Lee SH. Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies. Biomaterials. 35(23):5987-5997. 2014

86. Choi YY, Chung BG, Lee DH, Khademhosseini A, Kim JH, Lee SH. Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays. Biomaterials. 31(15):4296-43303. 2010

87. Niebruegge S, Bauwens CL, Peerani R, et al. Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor. Biotechnol Bioeng. 102(2):493-507. 2009.

88. Kim JM, Moon SH, Lee SG, et al. Assessment of Differentiation Aspects by the Morphological Classification of Embryoid Bodies Derived from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 20(11):1925-35. 2011.

89. Soldatenkov VA, Prasad S, Voloshin Y, Dritschilo A. Sodium butyrate induces apoptosis and accumulation of ubiquitinated proteins in human breast carcinoma cells. Cell Death Differ. 5(4):307-12. 1998.

90. Okudaira T, Yabuta R, Mizumoto H, Kajiwara T. Fabrication of a fiber-type hepatic tissue by bottom-up method using multilayer spheroids. J Biosci Bioeng. 123(6):739-747. 2017.

参考文献をもっと見る

全国の大学の
卒論・修論・学位論文
を
一発検索！

この論文の関連論文を見る