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Expression dynamics of HAND1/2 in in vitro human cardiomyocyte differentiation

Okubo, Chikako 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23471

2021.09.24

概要

Hand1 とHand2 は中胚葉から左心室右心室に至るまで重要な役割を果たしていることが示唆されているが、ヒトの心形成におけるHAND1 とHAND2 の発現動態や機能はほとんど調べられていない。

そこで、ヒトiPS 細胞にゲノム編集を行い、HAND1mCherryHAND2EGFP レポーター細胞株を作成し た。ヒトiPS 細胞の心臓分化に伴う発現動態を分化1 日目から20 日目までフローサイトメーターで観察したところ、mCherry は3 日目から検出され、5 日目にはmCherry 陽性およびmCherry 陰性の集団が観察された。その後、EGFP の発現が始まり、20 日目の心筋細胞中には、4 つの集団(mCherry 陰性EGFP 陰性、mCherry 陰性EGFP 陽性、mCherry 陽性EGFP 陰性、mCherry 陽性EGFP 陽性)が観察された。

まず、5 日目のmCherry 陽性及び陰性集団を分取したところ、mCherry 陽性細胞は、心筋細胞分化において重要な遺伝子の発現レベルが mCherry 陰性細胞よりも高く、心筋前駆細胞マーカーの発現も mCherry の発現と相関していた。さらに、細胞標識システムを構築し、5 日目のmCherry 陽性及び陰性細胞を追跡したところ、20 日目においてmCherry 陰性細胞は培養皿中で維持されていなかった。以上のことから、初期段階でのHAND1 の発現は、心筋前駆細胞の目印となることがわかった。

次に、分化誘導に必要なサイトカインの濃度を変化させ HAND1 とHAND2 の発現を調べた。分化初期における HAND1 は、BMP シグナル、Activin シグナルによってそれぞれ正と負に制御されていた。分化誘導後期には、BMP シグナルの阻害剤を投与することにより mCherry の発現量が下がったことから、後期においてもBMP シグナルによるHAND1 の発現制御が明らかにされた。一方、HAND2はヒトの心房では特に高い発現率を示している。レチノイン酸(RA)を用いて心房筋を誘導したところ、 RA はmCherry の発現を抑制し、EGFP の発現を促すことが示された。

20 日目の4つの心室筋細胞集団の特徴を明らかにするために、RNA-seq を行った。その結果、mCherry陽性心筋細胞において細胞周期が活性化している可能性が示唆され、EdU を用いて細胞増殖率を調べたところ、mCherry 陽性心筋細胞はmCherry 陰性心筋細胞に比べてEdU 陽性比率が有意に高かった。次に、上流解析を行い LEF1 遺伝子が上流因子として予測された。LEF1 を発現抑制すると、EdU 陽性比率が有意に低下したが、HAND1 や HAND2 の発現抑制実験では低下しなかった。興味深いことに、HAND1 および HAND2 の発現抑制実験では、LEF1 の発現が有意に増加し、逆にLEF1 の発現抑制では HAND1 および HAND2 の発現が有意に増加した。このことから心筋細胞の増殖ではLEF1を中心としたHAND1、HAND2 を含む遺伝子制御ネットワークが示唆された。最後に、増殖性心筋細胞マーカーを探索し、mCherry 陽性心筋細胞で高い発現を示した CD105 を同定した。20 日目に心筋細胞中の CD105 陽性及び陰性の集団を選別したところ、CD105 陽性心筋細胞の EdU 陽性比率と HAND1 の発現レベルは、CD105 陰性心筋細胞よりも高かった。

本研究において、試験管内でのヒトの心筋細胞の分化誘導過程での HAND1 及びHAND2 の発現パターンおよび増殖メカニズムに迫ることができ、今後ヒトの心臓の発生過程の研究に貢献することが期待される。

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参考文献

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