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極少数ヒト精子およびヒト精巣がん患者の精巣組織の凍結保存を可能にするための新規凍結コンテナーおよびプロトコルの開発と臨床応用

鎌田 久美子 山梨大学 DOI:info:doi/10.34429/00004975

2021.03.23

概要

WHO によると不妊原因に男性因子が関係しているのは、全体の 50%である。しかしなが ら、ヒト生殖補助医療 (Assisted Reproduction Technology: ART) において、女性側への治療技術の進歩、卵子や胚培養方法などの技術の向上は目覚ましいが、男性側、精子の取り扱いについてはこの 30 年ほとんど技術が変わっていない現状が挙げられる。我が国のARTにおいては、精子数が少ないために顕微授精の割合が年々増加している。そこで、極少数の精子を確実に凍結融解できるコンテナーの開発と凍結融解の方法が必要であると考えた。また、精巣がん患者は日本においても世界的にも、射出精液の凍結が勧められているのが、現状である。その理由には、精巣組織凍結は研究段階であるからである。そこで、マウスおよびヒト精巣がん患者の精巣組織凍結方法の開発に取り組んだ。

第一章 極少数ヒト精子の凍結保存を可能にするための新規凍結コンテナーおよびプロトコルの開発
極少数の精子の患者に対しても、健常男性の精子と同様の凍結融解方法が用いられ、融解後に凍結液を洗浄する過程で、極少数の患者精子の多くが失われている。ヒト精子の凍結融解の従来法は、1.8ml のクライオチューブで 200µL~1mL の精子凍結液に精子を混和させ凍結し、解凍は 6mL の精子用の培養液に精子凍結液を混和させ、遠心処置を行い、沈殿した精子を回収する。この過程で精子が約 20~30%失われてしまう。大量の精子を有する患者であれば、凍結融解の過程で精子数が減少しても顕微授精や体外受精に使用可能だが、極少数の精子を有する患者の場合は、精子を失えば治療が不可能になる。開発した「MAYU」での精子凍結は、恒温槽を使用せず、倒立顕微鏡下で精子をガラスキャピラリーで吸引し、培養液のドロップで洗浄するため大量の洗浄液用の培養液も、遠心処置も必要がない。「MAYU」のヒトへの臨床応用を目指し、マウスで基礎実験を行った。「MAYU」で凍結したマウス精子の体外発生能力および産仔発生能力を確認し、ヒトの精子においても「MAYU」で凍結融解を行った。

結論として、1) 極少数のヒト精子 11 名の精子を「MAYU」と「クライオトップ」という卵子や胚の凍結デバイスで、凍結融解の比較を行ったところ、「MAYU」では 96.7%の精子が回収できたのに対して、「クライオトップ」では 21.2%であり、有意に「MAYU」の融解後の回収率が高かった(P<0.05)。2) 凍結融解後の運動率においても、「クライオトップ」が 19.2%であったのに対して、「MAYU」では 35.0%であった。3) マウスにおいて、「MAYU」とマウス精子の凍結の従来法である「ストロー」と新鮮精子を用いて、体外培養実験と産仔率の比較を行った。新鮮精子の受精率は 100%であったのに対して、「MAYU」では 90.3%、「ストロー」では 86.6%であった。胚盤胞発生率では、新鮮精子では 91.9%であったのに対して、「MAYU」では 77.2%、「ストロー」では 80.3%であった。偽妊娠誘起させたレシピエントマウスに胚盤胞移植を行ったところ、新鮮精子の産仔率は 29.8%であったのに対して、「MAYU」では 16.9%、「ストロー」では 17.1%であった。新鮮精子と比較すると「MAYU」および「ストロー」は、受精率、胚盤胞発生率、産仔率ともに有意に低い結果であったが、凍結区である「MAYU」は、従来法の「ストロー」と同等の結果を示した。4)「MAYU」を使用することにより、極少数の精子凍結方法が「クライオトップ」法よりも高い結果を示し、マウスにおいても健常な産仔が得られ、発育も新鮮精子由来の産仔と変わらなかったという成果を得た。2018 年に商標「MAYU」を登録し、 2019 年特許を取得した。

第二章 「ヒト精巣がん患者の精巣組織の凍結保存を可能にするための新規凍結コンテナーおよびプロトコルの開発」
次に「MAYU」の特徴である簡便な凍結方法と底面の透明度の高さを利用して、精巣組織凍結融解方法の確立を目指した。精巣がん患者はがんの進行が早く緊急性が高い場合、すぐに精巣の摘出手術が行われる。そのため、射出精液の凍結保存が間に合わない場合も多い。さらに、精巣がん患者の場合、射出精液中の精子も数が減少し、異常精子が多いことも報告されている。精巣がん患者は、手術後に化学療法や放射線治療が行われるため、患者の精子の造精能力は極度に低下し、精子のDNA の異常が多いことが報告されている。がんを発症するのは生殖年齢期と重なるため、精子が確保できない状況は、夫婦の子供を望むことを諦めざるを得ない。精巣がん患者は日本のみではなく、海外では特に多く、精巣組織凍結融解方法の確立は、意義のある研究である。
そこで、「MAYU」を用いて、マウスの精巣組織凍結を行った。「MAYU」との比較のため、精巣組織の凍結で汎用されている「クライオチューブ」をコンテナー同士の比較、凍結液として、細胞や組織凍結で使用されている「Cellbanker1」とマウス精子凍結用の「FERTIUP 」の 2 種類の比較、凍結速度として、「Rapid」と「Slow」の比較、新鮮精巣組織との比較、合計 9 区の比較を行った。その結果、MAYU-Cellbanker1-Slow が他の 7 区よりも精子運動率、生存率が高かった。「MAYU」および「Cryotube」、「Cellbanker1」および「FERTIUP 」を「Slow」で凍結融解を行った。4 区と新鮮区の精子を使用し、マウス卵子に顕微授精を行い、受精率、体外培養後の発生率、胚移植後の産仔率の比較を行った。「MAYU」を使用して、健常な産仔を得た。さらに、金沢大学の倫理委員会の承認を得て、5 名の精巣がん患者の精巣組織凍結を行い、5 名全ての患者から融解後に運動精子を得ることができた。「MAYU」による精巣組織凍結は、精巣がん患者の妊孕性温存に寄与するものになると考える。

総括
「MAYU」により、極少数のヒト精子であっても、凍結融解の過程で精子数を減少させることなく凍結保存ができた。また、マウスによる基礎実験で、産仔を得て、健常に発育したことからも安全性を確認できた。さらに精巣がん患者の精巣組織の凍結融解にも、「MAYU」を使用し、運動精子を得ることができた。マウス精巣組織の凍結融解においても、産仔を得て、健常に発育したことからも安全性を確認できた。「MAYU」は極少数精子の凍結保存だけでなく、精巣組織保存にも有効であると考える。

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