論文の公開元へヒト顎骨由来骨芽細胞におけるMelatoninによるRunx2発現誘導メカニズムの解析
概要
ヒト顎骨由来骨芽細胞における Melatonin による Runx2 発現誘導メカニズム
の解析
主指導教員：菅井 基行客員教授
（国立感染症研究所
薬剤耐性学）
副指導教員：谷本 幸太郎教授
（医系科学研究科
歯科矯正学）
副指導教員：武知 正晃准教授
（医系科学研究科
口腔外科学）
室積
博
（医歯薬保健学研究科 医歯薬学専攻）
Ⅰ．
緒言
松果体より分泌されるホルモンである Melatonin (MEL)は，概日リズムの調
整をはじめとして，神経保護作用や腫瘍抑制作用などの様々な働きを有する(1)．
また，MEL は未分化間葉系細胞の分化や前骨芽細胞の分化を促進し，骨形成に
重要な役割を担う (2,3)．さらに MEL は，in vitro にてマウス骨芽細胞(MC3T3E1)の石灰化能の亢進に関与し，インプラント周囲の新生骨の形成やオッセオイ
ンテグレーションの促進に関与することが明らかとなった(4,5)．
TGF-は，MAPK-ERK シグナル伝達経路を介して，骨芽細胞の分化や石灰
化の制御に関与している(6)．しかしながら，MEL によって促進される石灰化と
TGF-により活性化される MAPK-ERK シグナル伝達経路との関係については
不明である．また，microRNA（miRNA）は様々な遺伝子発現の制御を行うこ
とにより，分化や発生の調節に重要な役割を担っている(7)．骨芽細胞において
は，miRNA が Runx2 の発現を制御することにより，骨分化の調節に関与する
との報告がある(8)．しかしながら，MEL により誘導される骨芽細胞の石灰化に
miRNA がどのように関与してるかは未だ明らかでない．そのため本研究では，
ヒト顎骨由来骨芽細胞を用いて，MEL による Runx2 の発現誘導メカニズムを
明らかとし，さらに MEL により発現誘導される miRNA の役割について検討す
ることとした．また，連通多孔体ハイドロキシアパタイト(Interconnected
Porous Hydroxyapatite Ceramics：IP-CHA)は，優れた骨伝導能を有する骨補
填材として広く臨床応用されている．MEL などの骨形成に関係する因子を IPCHA 内に導入することにより，さらに骨芽細胞の石灰化能がより促進される可
能性があると考えられる．そのため今回，MEL 徐放能を有する IP-CHA を作製
し，IP-CHA 内で培養したヒト顎骨由来骨芽細胞の石灰化能について検討を行
なった．
1
Ⅱ．実験材料および実験方法
1．細胞培養
広島大学疫学研究倫理審査委員会の承認のもと，患者より事前に同意を得て，
口腔顎顔面再建外科における手術の際に無菌的に採取したヒト正常顎骨由来の
小骨片を用いて，エクスプラント法によりヒト顎骨由来骨芽細胞(以下，hOB 細
胞と略記する)の初代培養を行なった．T-75 組織培養用フラスコ(Greiner
Bio
One，Duesseldorf，Germany)に 2～3 ㎜四方大に細断した組織片を静置し，培
地には 10％ウシ胎児血清，1％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した α 変
法イーグル培地(α-Minimum Essential medium：以下 α-MEM 培地と略記する；
SIGMA)を使用した．組織片細胞を 0.05％トリプシン-EDTA(SIGMA)を用いて
回収し継代培養を行なった．培養系は 95％air，5％CO2，37℃の条件下で維持
し，本実験では 3～6 継代細胞を用いた．hOB 細胞を分化するため，L-アラニル
-L- グ ル タ ミ ン を 含 む 石 灰 化 誘 導 培 地 (MSCgoTM OsteogenicXF ， Biological
Industries)で培養を行なった．1.0μM MEL(Sigma-Aldrich)および TGF-β1
(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 5.0 ng/ml で 72 時間処理し細胞を回
収した．
2．RNA 抽出および Real time-PCR 法
hOB 細胞から RNeasy Mini Kit (Qiagen，Hilden，Germany)を用いて，Total
RNA を抽出した．抽出した RNA の濃度をナノドロップ(Thermo Fisher
Scientific，Waltham，MA，USA)により測定した．Total RNA 1μg をテンプレ
ートとして Rever Tra Ace 1µl，RNAase inhibitor 1µl，5×RT buffer 4µl，dNTP
2µl，Randam primer 1µl を加えた反応液で逆転写反応を行なった．30℃10 分，
42℃20 分，99℃5 分，4℃5 分を Master cycler gradient(Eppendorf，Hamburg，
2
Germany)を用いて実施し ，20μL の 1 本鎖 cDNA を得た ．cDNA 1µl ，
THUNDERBIRD SYSER qPCR Mix(TOYOBO) 10µl，標的遺伝子特異的プラ
イマー（sence，antisence を各 1µl），DDW 7µl を用いて，CFX connect realtime PCR detection sytem（BioRad，Hercules，CA，USA）にて遺伝子発現量
を 解 析 し た ． 標 的 遺 伝 子 の 発 現 量 は ， Glycelaldehyde 3-phosphate
dehydrogenase（以下 G3PDH と略記）の発現量を基準として標準化した． PCR
プログラムは，95℃10 分の後，95℃15 秒，58℃30 秒，72℃40 秒の反応を 40
サイクル行なった．使用したプライマー(北海道システムサイエンス)の塩基配列
は表 1 に別記した．
3．タンパク質抽出および Western blotting
細胞をPBSにて洗浄後，0.05%トリプシン-EDTA（SIGMA）により細胞を剥
離，回収し4℃,15000rpmにて5分間遠心しペレットを得た．タンパク抽出には
Mammalian Cell Lysis Kit (Sigma-Aldrich)を用いた．1％プロテアーゼインヒ
ビター(Roche，Indianapolis，IN，USA)を添加した100μLの氷冷Lysis bufferを
回収したペレットに添加し，100回ピペッティングを行い，60分氷上にて振盪し
た後，4℃，13000rpmにて10分遠心後，上清をサンプルとして回収した．サン
プルのタンパク質濃度はProtein Assay（Bio Rad，Hercules，California，USA）
を用いて定量した．抽出した各種サンプルに5×sample buffer (1M Tris-HCL
pH6.8，10％SDS，glycerol，5％ 2-メルカプトエタノール，ブロモフェノール
ブルー)を加えた後，95℃で5分加熱し，ただちに4％スタッキングゲル，10％ラ
ンニングゲルを用いて電気泳動を行なった．サンプルはImmobilon-P PVDFメ
ンブレン (Millipore corporate Headquarters，Billerica，MA，USA)に転写後，
ブロッキングワンP
(ナカライテスク，京都)により室温にて1時間ブロッキング
3
を 行 な っ た ． 1 次 抗 体 anti-human Runx2 mouse monoclonal (Abcam ，
Cambridge，UK)，anti-human ERK1/2 rabbit monoclonal (Cell Signaling
Technology，Beverly， MA，USA)，anti-human phosphorylated-ERK1/2 rabbit
monoclonal (Cell Signaling Technology) ， anti-human Smad2 rabbit
monoclonal (Cell Signaling Technology) ， anti-human Smad3 rabbit
monoclonal (Cell Signaling Technology)，anti-human phosphorylated-Smad2
rabbit monoclonal (Cell Signaling Technology)，anti-human phosphorylatedSmad3 rabbit monoclonal (Cell Signaling Technology) の抗体反応は各抗体に
添付された条件に従い，5％牛血清アルブミンを含む TBS-T
(20mM Tris-HCL
(pH7.6)，0．14M NaCl，0.05％Tween-20)にて4℃で over nightにて行なった．
2次抗体反応はECL Anti-Rabbit IgG，Horseradish Peroxidase-Linked Whole
Antibody (GE ヘルスケア・ジャパン株式会社，東京)をTBS-Tにて1000倍希釈
した反応液を用いて室温60分にて行なった．2次抗体反応後，TBS-Tにて洗浄し，
ECL TM Plus Western blotting system (GE ヘルスケア・ジャパン株式会社)を
発光基質として添加し，LAS 4000 mini（Fuji film，東京）を用いて発光シグナ
ルを検出した．NIH ImageJ (Version 1.47)を用いて, Western blotting により
得られたバンドの濃度を測定し、タンパク質発現を定量化した。 ...
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