細胞老化におけるMDM4の選択的スプライシング制御を介したスプライシング因子PRPF19の役割

概要

博士論文

細胞老化における MDM4 の選択的スプライシング制御を介した
スプライシング因子 PRPF19 の役割

広島大学大学院医歯薬保健学研究科

医歯薬学専攻

細胞分子生物学研究室

平成２９年度入学

矢野

公義

主指導教員

田原

栄俊

目次

1.

研究背景……………………………………………………………………………………………2

2.

実験材料・方法……………………………………………………………………………………4

3.

結果…………………………………………………………………………………………………12

4.

考察…………………………………………………………………………………………………32

5.

参考文献……………………………………………………………………………………………34

6.

謝辞…………………………………………………………………………………………………37

1

1.

研究背景

1961 年に Hayflick らは、継代培養したヒトの正常線維芽細胞が一定回数の細胞分裂を繰り返した
後、不可逆的に細胞周期を停止することを観察し、この現象を「細胞老化」と名付けた 1。この細
胞老化は、DNA 複製に伴うテロメア短縮によって引き起こされ、一般的に「複製老化」と呼ばれ
ている。その後、放射線や化学療法剤によって誘発された DNA 損傷や RAS や PTEN などのがん
（抑制）遺伝子の（不）活性化によっても、分裂限界に達する前に細胞老化を誘導することが明
らかになった 2-4。細胞老化を誘導した細胞（以下、老化細胞）は、増殖能の低下の他にも、扁平
肥大化した細胞形態、βガラクトシダーゼ活性の上昇、クロマチン構造の変化、DNA 損傷応答の
活性化、様々な生理活性物質の分泌などの特徴を示す 5。これまでに、このような特徴を示す老化
細胞が生体内の様々な組織でも観察され、細胞老化の生理学的な役割に関する研究が数多く報告
されている 6。特に、細胞老化は p53-p21/p16-Rb がん抑制経路を介してゲノム異常を有した細胞
の無秩序な増殖を防ぐがん抑制機構の一つとして長い間考えられてきた。さらに、胚発生や損傷
修復、免疫応答にも細胞老化が関与することが報告され、生体の恒常性維持に重要な役割を果た
すことが明らかになった。その一方で、老化細胞から分泌される炎症性サイトカイン、細胞外マ
トリクス分解酵素、増殖因子、さらには細胞外小胞（エクソソーム）などが腫瘍の増殖や転移を
促進することが明らかになってきた。
p53 は「ゲノムの守護神」と呼ばれるように、様々なストレスに応答して活性化することによっ
て細胞老化の誘導とも密接に関与している 7。murine double minute 2（MDM2）や murine double
minute 4（MDM4）は主要な p53 抑制因子であり 8、これらの阻害は p53 の活性化を引き起こし、
アポトーシスや細胞老化を介した細胞増殖抑制作用を示すことが報告されている

9,10

。MDM2 は

E3 ユビキチンリガーゼ活性を持ち、プロテアソーム系を介して p53 を分解する一方で 11、MDM4
は E3 ユビキチンリガーゼ活性を持たないが、p53 と結合することによって MDM2 による p53 の
分解を促進する 12。MDM4 は、全長をコードする翻訳型 MDM4-FL とエクソン 6 のスキッピング
が起きた非翻訳型 MDM4-S の 2 種類の選択的スプライシングアイソフォームが存在することが
知られている。また、メラノーマ細胞では、serine-arginine-rich splicing factor 3（SRSF3）の発現抑
制は、MDM4-FL から MDM4-S へのスプライシング変換を引き起こすことによって p53 依存的な
アポトーシスを誘導する

13

。MDM4 は、複数のがん組織で高発現していることが検出され、p53

のがん抑制機能を低下させることから

14-17

、その選択的スプライシングの変化は発がん過程の重

18

要な要素として考えられている 。しかしながら、細胞老化における分子基盤における MDM4 の
選択的スプライシングの影響はほとんど明らかになっていない。
DNA 損傷応答もまた、
p53 を介した細胞老化誘導機構の主要なシグナル経路として機能している。
テロメア短縮による染色体末端の脱保護やがん遺伝子の活性化による DNA 複製ストレスなどは、
セリン／スレオニンキナーゼである ataxia telangiectasia mutated（ATM）や ataxia telangiectasia and
Rad3-related（ATR）を活性化させ、直接的に、もしくは下流エフェクターである checkpoint kinase
1/2（Chk1/2）のリン酸化を介して、p53 を活性化させる 19,20。活性化した p53 は、p21 をコードす
る cyclin dependent kinase inhibitor 1A（CDKN1A）や他の下流遺伝子の転写活性化を介して細胞周
期の停止を引き起こす。また近年、TP53 の選択的スプライシングアイソフォームである p53β の
2

発現が、DNA 損傷誘導性の細胞老化を制御していることが明らかになった

21

。これまでにも、

DNA 損傷応答は様々な遺伝子の選択的スプライシングを変化させることが報告されていること
から、RNA スプライシングの変化が細胞老化の誘導に重要な役割を果たしているのではないかと
考えられる 22。しかしながら、現在までにどのようなスプライシング因子が細胞老化を制御して
いるのかは十分に解明されていない。
本研究では、正常ヒト胎児肺由来二倍体線維芽細胞における細胞老化誘導機構を解析することに
よって、細胞老化を制御するスプライシング因子を同定し、スプライシング因子がどのように細
胞老化誘導に寄与しているのかを詳細に調べた。

3

2.

実験材料・方法

細胞培養

本実験には、正常ヒト胎児肺由来二倍体線維芽細胞株 TIG-3（Health Science Research Resources
Bank）
、正常ヒト胎児肺由来二倍体線維芽細胞株 MRC-5（National Institutes of Biomedical Innovation,
Health and Nutrition）、正常ヒト胎児肺由来二倍体線維芽細胞株 IMR-90（National Institutes of
Biomedical Innovation, Health and Nutrition）
、Lenti-X 293T（Clontech）を使用した。Lenti-X 293T 細
胞株は、ヒト胎児腎細胞株 HEK293T より SV40 ラージ T 抗原を高発現した細胞株を限外希釈法
により単離し、高力価なレンチウイルス産生を可能にするレンチウイルスパッケージング用細胞
株である。TIG-3 細胞と Lenti-X 293T 細胞は、10% FBS（GE Healthcare）を含有する Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium（Sigma-Aldrich）中で培養した。MRC-5 細胞と IMR-90 細胞は、10% FBS
を含有する Minimum Essential Medium Eagle
（Sigma-Aldrich）
中で培養した。
すべての細胞は、
37°C、
5% CO2 インキュベーター内で培養した。当研究室では、TIG-3 細胞は約 80 集団倍加レベル
（Population doubling levels: PDLs）
、MRC-5 細胞は約 70 PDLs、IMR-90 細胞は約 55 PDLs で細胞
老化様の細胞周期停止を誘導することを観察した。TIG-3 細胞において、継代早期細胞として 4159 PDLs、老化細胞として 77-83 PDLs の範囲で使用した。
PRPF19 及び MDM4 過剰発現細胞の樹立
cDNA 発現用レンチウイルスベクターpCDH-CMV-EF1-GFP-T2A-Puro（System Biosciences）を制限
酵素 EcoRI と NotI で切断した後、In-Fusion HD cloning kit（Takara Bio）を用いて PRPF19 及び
MDM4 の cDNA を組み込んだ。作製したベクターは、レンチウイルス用パッケージングベクター
pLP1, pLP2, pLP/VSVG（ViraPower lentiviral expression system, Invitogen）と共に、トランスフェク
ション試薬 Lipofectamine LTX and PLUS reagent（Invitrogen）を用いて Lenti-X 293T 細胞にフォワ
ードトランスフェクションして、その 24 時間後に培地交換した。培地交換して 24 時間後に、レ
ンチウイルスを含む培養上清を回収して、Lenti-X concentrator（Clontech）を用いてウイルス培養
液を濃縮した。PRPF19 及び MDM4 過剰発現細胞の樹立には TIG-3 細胞を使用し、レンチウイル
スを含む培地中で 24 時間培養した後、1 µg/mL のピューロマイシンを含有する培地中で継代培養
してピューロマイシン耐性細胞株を選択した。
3D-Gene マイクロアレイ解析
ISOGEN II（NIPPON GENE）を用いて、細胞からトータル RNA を抽出した。3D-Gene マイクロ
アレイ解析、パスウェイ解析（GenMAPP ver. 2.1, MAPP Finder）、遺伝子オントロジー解析
（GENECODIS2.0）は TORAY 株式会社に受託した。データは、Gene Expression Omnibus（GEO）
にアップロードした（GSE162201）
。
リアルタイム PCR 解析

4

miRNeasy Mini kit（QIAGEN）もしくは ISOGEN II を用いて、細胞からトータル RNA を抽出した。
mRNA の発現量を解析するために、High-Capacity RNA-to-cDNA kit（Applied Biosystems）を用い
て逆転写を行い、KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2×) Universal（KAPA Biosystems）を用いて
リアルタイム PCR 解析を行なった。PCR 装置として Rotor-Gene Q（QIAGEN）を使用した。mRNA
の相対発現量比は、2-ΔΔCt 法によって算出した。使用した PCR プライマーリストは表１に示して
いる。
ウェスタンブロット解析

細胞を 2×SDS sample buffer [116.7 mM Tris-HCl (pH 6.8), 3.67% (w/v) SDS, 0.004% (w/v) BPB, 12%
(w/v) glycerol, 200 mM DTT]中で溶解し、95°C で約 5-10 分間熱変性処理を行なった。XL-Bradford
（APRO Science）を用いてサンプルのタンパク質定量を行なった後、SDS ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によってタンパク質を分離して、
ゲルから PVDF メンブレンにタンパク質を転写した。
メンブレンは、ブロッキング処理終了後に、室温で約 3 時間もしくは 4°C で一晩、一次抗体希釈
液中でインキュベートした。一次抗体反応終了後、メンブレンを洗浄して、室温で約 30-60 分間、
二次抗体希釈液中でインキュベートした。二次抗体反応終了後、メンブレンを洗浄して、化学発
光試薬 Western Lightning Plus-ECL（PerkinElmer）もしくは ImmunoStar Zeta（FUJIFILM Wako Pure
Chemical Co.）に浸した。イメージング装置 ImageQuant LAS 4000mini（GE Healthcare）もしくは
FUSION SYSTEM（Vilber-Lourmat）を使用して、化学発光シグナルを検出してタンパク質発現量
を解析した。使用した抗体リストは表２に示している。
siRNA のトランスフェクション
トランスフェクション試薬 Lipofectamine RNA-MAX transfection reagent（Invitrogen）を用いて、細
胞に siRNA を最終濃度 10 nM になるようにリバーストランスフェクションした。使用した siRNA
リストは表３に示している。
老化関連βガラクトシダーゼ活性の評価

細胞を 100 nM のバフィロマイシン A を添加した培地中で 1 時間培養した後、1 µM の SPiDERβGal（DOJINDO）を添加して 15 分間培養した。その後、細胞を回収して、フローサイトメータ
ーFACSCalibur（BD Biosciences）を用いて蛍光を検出した。前方散乱と側方散乱をもとにゲート
を設定し、ゲート中の 10,000 細胞を解析して、FL1 ヒストグラムを作製した。データ解析には
FlowJo（FlowJo LLC）を使用した。
老化関連ヘテロクロマチン構造の観察

チャンバースライドに細胞を用意して、4%パラホルムアルデヒドによって室温で 10 分間固定処
理した。固定処理終了後、0.2% Triton-X 100 によって室温で 5 分間透過処理した。透過処理終了
後、3% BSA で 5 分間ブロッキング処理をして、室温で 2 時間、anti-trimethyl-Histone H3 (Lys9)
5

（1:500, Merck Millipore, #07-422）の一次抗体希釈中でインキュベートした。一次抗体反応終了後、
サンプルを洗浄して、室温暗所で 1 時間、Alexa Fluor 594-conjugated anti-Rabbit IgG（1:1,000,
Invitrogen）の二次抗体希釈液中でインキュベートした。二次抗体反応終了後、室温で 3 分間、0.15
µg/mL DAPI（DOJINDO）希釈液中でインキュベートした。洗浄後、Fluorescence Mounting Medium
（Dako）を滴下し、カバーガラスを乗せて密閉した。蛍光顕微鏡 BZ-X810 All-in-One（KEYENCE）
を使用して、核内の老化関連ヘテロクロマチン構造を観察した。
EdU 細胞増殖試験
24 穴プレートに細胞を用意して、10 µM の EdU を含む培地中で 24 時間培養した。その後、ClickiT Plus EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit（Molecular Probes）を用いて、細胞を染色した。蛍光顕微
鏡 BZ-X810 All-in-One を使用して、細胞を観察した。
一本鎖 DNA の検出

細胞を 20 µM の BrdU を含む培地中で 48 時間培養した後、siRNA をトランスフェクションした。
サンプルは、70%エタノール中で固定処理した後、37°C で 1 時間、anti-BrdU（1:200, Dako, M0744）
の一次抗体希釈液中でインキュベートした。一次抗体反応終了後、サンプルを洗浄して、室温暗
所で 1 時間、Alexa Fluor 488-conjugated anti-Mouse IgG（1:1,000, Invitrogen）の二次抗体希釈液中で
インキュベートした。二次抗体反応終了後、50 µg/mL の PI（Sigma-Aldrich）と 100 µg/mL の RNase
A（QIAGEN）を含む PBS(-)中で細胞を懸濁して、その 30 分後に、フローサイトメーター
FACSCalibur を用いて蛍光を検出した。
コメットアッセイ

Comet Assay kit（Trevigen）を用いて、アルカリ性条件コメットアッセイを行なった。テール中の
DNA 量は、TriTek Comet Score (ver. 1.5) software（TriTek Corp.）を用いて測定した。
PCR 法によるスプライシングアイソフォーム発現量解析
miRNeasy Mini kit を用いて、細胞からトータル RNA を抽出した。RNA 抽出過程において、Rnasefree Dnase set（QIAGEN）を用いて Dnase 処理過程を追加した。High-Capacity RNA-to-cDNA kit を
用いて逆転写を行い、KOD -plus- ver.2（TOYOBO）を用いて PCR を行なった。PCR 反応条件は、
前処理変性を 94°C で 2 分間行なった後に、変性（98°C、10 秒）
、アニーリング（57°C、30 秒）
、
伸長（68°C、30 秒）を 30 サイクルで行なった。その後、アガロース電気泳動によって PCR 増幅
産物を分離した。サンプルには Midori Green Direct（NIPPON Genetics）を添加し、ゲル撮影装置
LED トランスイルミネーター（BIO CRAFT）を使用して PCR 増幅産物を観察した。使用した PCR
プライマーリストは表１に示している。
RNA シークエンス解析
6

miRNeasy Mini kit を用いて、細胞からトータル RNA を抽出した。RNA 抽出過程において、Rnasefree Dnase set を用いて Dnase 処理過程を追加した。RNA 品質解析（NanoDrop 8000 Microvolume
UV-Vis spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific; Agilent RNA 6000 Nano kit, Agilent Technologies）
、
ライブラリー調整（SMARTer Standard Total RNA Sample Prep Kit – HI Mammalian, Takara Bio;
AMPure XP beads, Beckman Coulter）
、次世代シークエンス解析（HiSeq sequencer, Illumina）
、データ
解析は、株式会社ダナフォームに受託した。シークエンスの生データの品質確認（FASTQC ver.
0.11.7）
、トリミング（Trim Galore! Ver. 0.4.4, Trimmomatic ver. 0.36）
、フィルタリング（cutadapt ver.
1.16）を行なった後に、ヒトゲノム GRCh38.p10 にマッピング（STAR ver. 2.6.1a）した。選択的ス
プライシング変化を解析するために、rMATS ver. 4.0.2 を使用した。また、MDM4 のスプライシン
グ変化を示すゲノムアノテーションは Integrative Genomics Viewer ver. 2.4.16 を使用した。データ
は、Gene Expression Omnibus（GEO）にアップロードした（GSE168391）
。
共免疫沈降

細胞を 1×cell lysis buffer [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% (v/v) NP-40, 1 mM EDTA, 5%
(v/v) glycerol, protease inhibitors]中で溶解した後、Protein G beads（GE Healthcare）を添加して 4°C
で 1 時間、
前洗浄した。
前洗浄した細胞溶解液に 2 µg の normal rabbit IgG
（Santa Cruz Biotechnology）
もしくは anti-PRPF3（Proteintech, 10106-1-AP）を添加して、4°C で一晩インキュベートした。そ
の後、Protein G beads を添加して 4°C で 2 時間インキュベートした。1×cell lysis buffer で洗浄後、
2×SDS sample buffer でビーズからタンパク質を溶出した。タンパク質溶出液はウェスタンブロッ
ト法によって解析した。
統計解析

GraphPad Prism 8 software（GraphPad Software）を用いて、データの統計学的処理を行なった。棒
グラフデータには、平均値及び標準偏差を示した。有意差検定には、スチューデントの t 検定に
よって p 値を算出した。Not significant（n.s.）は p ≥ 0.05、*は p < 0.05、**は p < 0.01、***は p <
0.001 を示している。 ...

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