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Activation of transient receptor potential vanilloid 4 protects articular cartilage against inflammatory responses via CaMKK/AMPK/NF-κB signaling pathway

服部, 恭典 名古屋大学

2022.02.28

概要

【緒言】
Transientreceptorpotentialvanilloid4(TRPV4)はCa2+細胞内取り込みに関連するイオンチャネルであり、軟骨細胞への機械的ストレス負荷をCa2+シグナリングを介して細胞内伝達を行う際に重要な役割を果たしている。一方、変形性関節症(OA)の進行におけるTRPV4の役割については不明点が多く、現時点ではinvitroおよびinvivoにおいて軟骨保護作用と軟骨破壊作用の両方が報告されている。

我々は過去にTRPV4活性化が軟骨細胞でのAGCやSOX9の発現亢進を来すことを報告したが、その機序は不明だった。近年、慢性疾患においてCa2+細胞内取り込みがカルモジュリンキナーゼキナーゼ(CaMKK)活性化を介してAMPK活性化を生じることが報告されている。我々はまた、軟骨細胞においてAMPK活性化がIL-1βによる炎症反応を抑制することも報告しており、軟骨細胞においてもCa2+シグナリングを介したCaMKK活性化およびAMPK活性化を介した抗炎症作用や軟骨保護作用があるのではないかと仮定した。

この検討では、ウシ軟骨細胞(BAC)およびヒト軟骨細胞(HAC)を用いて、TRPV4活性化によって生じる抗炎症作用および抗軟骨破壊作用の可能性を調べた。また、その経路の探索を行った。我々の研究は、OA治療のための新規ターゲット開発に有用であると考えている。

【対象及び方法】
BACおよびHACに対して、IL-1βにより炎症反応を惹起した。TRPV4アゴニストであるGSK101を用いてTRPV4活性化を誘発した。経路の探索のためにCaMKK阻害剤であるSTO-609(5µM)およびAMPK阻害剤であるCompoundC(25µM)を用いた。適切な軟骨保護作用を示すTRPV4活性化の程度の探索のため、BACおよびHACにおいて、GSK101に対するMTSassayを行った。また、BACにおいては、IL-1βとGSK101とで共培養した際のMMP-13、AGC、SOX9発現変化におけるGSK101の濃度依存性も評価した。TRPV4活性化を介した軟骨保護作用は、BACにおけるMMP-13、AGC、SOX9の発現変化のPCR、およびHACにおけるMMP-13の発現変化のPCRおよびWesternblot analysisにて評価した。BACにおけるAMPK活性およびNF-κB活性の変化をWesternblot analysisにて評価した。

ウシ軟骨切片をIL-1βおよびGSK101の存在下で培養し、3日目のメディウムを用いてdimethylmethylene blue(DMMB)assayを、7日目の軟骨切片を用いてSafraninO/Fast Green染色をそれぞれ行い、軟骨に含まれるプロテオグリカンの分解の変化を評価した。

【結果】
BACおよびHACにおいてGSK101に対するMTSassayを行うと、1000pMまでは細胞毒性を生じなかった一方で、10000pMでは細胞毒性を生じた(図1a)。BACにおけるIL-1βとGSK101による共培養では、IL-1βによって惹起されたMMP-13の上昇とAGCおよびSOX9の低下が、GSK101併用下では濃度依存的に抑制されていた(図1b)。これらから、GSK101は1000pMにおいて最も抗炎症作用を示すことが予想されたため、以下の実験におけるTRPV4活性化のためには1000pMのGSK101を用いることとした。

次に、GSK101の抗炎症作用を示すため、HACに対してIL-1βとGSK101による共培養を行い、MMP-13の発現変化をPCRとWesternblot analysisにて評価したところ、いずれにおいてもIL-1βによって発現亢進したMMP-13は、GSK101併存下において発現低下していた(図2a-b)。さらに、ウシ軟骨切片に対してIL-1βとGSK101による共培養を行い、軟骨中プロテオグリカンの分解を評価したところ、DMMBassayではIL-1βによって上昇したメディウム中のプロテオグリカン濃度がGSK101併存下においては低下し、SafraninO/Fast Green染色ではIL-1βによって低下したプロテオグリカン染色性がGSK101併存下においては回復していた(図2c-d)。これらから、TRPV4活性化はIL-1βが惹起する軟骨破壊作用を抑制すると考えられた。

GSK101の作用の細胞内シグナル伝達経路を探索するため、BACに対してSTO-609もしくはCompoundCによる前処置をした上で、IL-1βとGSK101による共培養を行い、AMPK活性化およびNF-κB活性化の変化を評価したところ、IL-1βによってNFκBは活性化する一方、GSK101単独でもAMPK活性化が生じていた。IL-1βとGSK101の併存下では、AMPK活性化が生じるとともにNF-κBの活性化が抑制されていた。STO-609およびCompoundCでの前処置を行うと、それぞれIL-1βとGSK101の併存下においても、AMPK活性化は抑制され、NF-κBの活性化が生じていた(図3a-b)。これらから、TRPV4活性化はCaMKK活性化およびAMPK活性化を介してNF-κB活性化阻害をすることで軟骨保護作用を示していると考えられた。

最後に、TRPV4活性化を介したCaMKK活性化が軟骨保護作用を示すことを証明するため、BACおよびHACに対してSTO-609による前処置をした上で、IL-1βとGSK101による共培養を行ったところ、BACにおいてIL-1βによって惹起された軟骨破壊性変化は、IL-1βとGSK101の併存下において抑制されたが、STO-609前処置を行うとGSK101による軟骨破壊抑制作用がキャンセルされていた(図4a)。HACにおいても、IL-1βによって惹起されたMMP-13発現亢進はIL-1βとGSK101の併存下において抑制されたが、STO-609前処置を行うとGSK101によるMMP-13発現抑制作用がキャンセルされていた(図4b-c)。

【考察】
軟骨細胞における機械的ストレス負荷が抗炎症作用を示すことの報告やAMPK活性化を介した抗炎症作用の報告、腫瘍や糖尿病など慢性炎症性疾患におけるCa2+/CaMKK/AMPK経路を介したNF-κB活性化抑制作用についての報告などが存在する一方、軟骨細胞におけるTRPV4/CaMKK/AMPK経路を介したNF-κB活性化抑制作用および軟骨保護作用の報告は本研究が初である。

TRPV4のinvitroにおける軟骨細胞に対する影響は、ADAM10などの発現亢進など軟骨破壊作用を示すとする報告と、COL2発現亢進やADAMTS5発現抑制など軟骨保護作用を示すとする報告との両方がなされている。TRPV4のinvivoにおける影響もまた、TRPV4ノックアウトマウスにてOAが進行するとする報告と、OAが抑制されるとする報告との両方がなされている。本研究では、適切な濃度のGSK101が軟骨保護作用を示した一方、一定以上の濃度のGSK101を用いると細胞毒性が生じ、TRPV4活性化には適切な程度があると考えられた。

AMPK活性化がなぜNF-κB活性化抑制作用を持つのかはまだ不明点が多い。軟骨細胞に対する過去の報告において、AMPK活性化を介してSIRT1、PGC-1α、FOXO3aなどの因子が活性化し、抗炎症作用を示すとするものがある。我々は近年、軟骨細胞の糖代謝と炎症性変化との関連に注目しており、IL-1βによって亢進した嫌気性解糖系がAMPK活性化により好気性解糖系にシフトすることを報告した。これらの経路が今後のOA治療ターゲットとなっていく可能性がある。

【結論】
TRPV4活性化は、CaMKK活性化およびAMPK活性化を介してNF-κB活性化を抑制することで、IL-1βが惹起する軟骨細胞のMMP-13発現上昇やAGCおよびSOX9の発現低下などの炎症反応、および軟骨破壊を抑制した。TRPV4/CaMKK/AMPK経路は、IL-1βによる関節軟骨破壊やOAの進行に対して重要な役割を果たしていると考えられた。AMPK活性化によるNF-κB活性化抑制のメカニズムはまだ不明だが、AMPKと関連するSIRT1、PGC-1α、FOXO3aなどのシグナル伝達経路が軟骨細胞のNF-κB活性化を抑制することで、IL-1βが惹起するの炎症反応を抑制することが報告されており、TRPV4活性化を生じる薬剤は、OAの進行を防ぐための有望な治療法になることが期待された。

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