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4-Methylumbelliferone suppresses catabolic activation in anterior cruciate ligament-derived cells via a mechanism independent of hyaluronan inhibition

井戸田, 大 名古屋大学

2022.02.28

概要

【緒言】
変形性関節症(OA)は高齢化社会である本邦において最も一般的な関節障害であり、今後も患者数が増加することが予想される。膝OAにおいては軟骨、半月板だけでなく前十字靭帯(ACL)もOA関連サイトカインや酵素による炎症性変化の影響を受け変性・断裂を来すと考えられている。ACLの変性断裂は生体力学的変化を介して膝OAの進行に寄与すると考えられる。近年、単顆型人工膝関節置換術、骨切り術などのACLを温存した膝OAに対する外科的治療選択の増加に伴い、保存的治療においては関節内靭帯に対する抗炎症作用も必要であると考えられる。

これまでに炎症性サイトカイン(Interleukin[IL]-1β、IL-6、Tumor Necrosis Factor[TNF]-α)や酵素(matrix metallo proteinase[MMP]-1、MMP-3、MMP-13)など、軟骨の変性や膝OAの発症に関与する様々な経路やメディエーターが報告されている。これらのOA関連分子は、軟骨の変性だけでなく、変性靭帯の断裂にも重要な役割を果たしている。しかし、靭帯の変性の原因となる病態は十分に解明されていない。靭帯は様々なコラーゲン繊維で構成されているため、コラゲナーゼとして知られるMMPは、靭帯の主要成分を分解する上で重要な役割を果たしている。したがって、変性靭帯の断裂を防ぐためには、MMPの発現とその上流のメディエーターを抑制することが重要な治療法となり得る。

我々はOA軟骨におけるヒアルロン酸(HA)合成阻害剤である4-methylumbeliferone(4-MU)の抗炎症作用を過去に報告している。一方で、靭帯細胞の炎症に着目した研究は少なく、4-MUが靭帯細胞に対して抗炎症作用を持つか否かを評価したものはない。本研究の目的は、ACL由来の細胞におけるIL-1βによるMMP-1、MMP-3、IL-6の発現亢進に4-MUが影響を与えるか否かを調べることである。

【対象及び方法】
ヒトOA-ACL由来細胞は人工膝関節全置換術時に採取したACLから細胞を単離、培養した。培養細胞での炎症性変化の誘導はIL-1β0.1ng/mlを用いた。4-MUはIL-1βと同時に投与し、12時間培養した。ACL組織片培養での炎症性変化の誘導はIL-1β2.0ng/mlを用い、4-MU1.0mMの存在下または非存在下で1週間培養した。その後、ACL組織を切片化し、免疫組織染色を行い解析した。取得した画像は、ImageJFiji (https://imagej.net/software/fiji/)を用い、核及び細胞質のmean gray valuesを測定して定量化した。MMP-1、MMP-3、IL-6のmRNA発現量はreal-timeRT-PCR法により測定した。MMP-1、MMP-3、IL-6のタンパク発現量はcapillary westernimmunoassay (Protein Simple, aBio-Techne Brand)により定量した。培養細胞のHA産生は、培養上清液を回収し、酵素結合サンドイッチアッセイ(Hyaluronan Duo Set ELISA, R&D Systems)により定量した。培養上清液中の乳酸濃度は、L-Lactate Assay KitI (Eton Bioscience, Research Triangle)を用いて測定した。細胞内代謝はSeahorse Fluxanalyzer (Agilent Technologies)を用い、嫌気性解糖系、好気性解糖系の状態を評価した。

【結果】
IL-1β刺激によりACL由来細胞におけるMMP-1、-3、IL-6のmRNAおよびタンパクの発現が亢進した。それらのmRNAおよびタンパクの発現亢進は4-MUにより抑制された(図1)。免疫組織化学染色にて組織片においてもIL-1β刺激によりMMP-1、-3、IL-6の染色性が増強し、4-MU存在下ではその染色性が抑制された(図2)。

ACL由来細胞において、IL-1β刺激によりHA合成は亢進し、4-MUによりHA合成の亢進が抑制された(図3)。4-MUによるMMP-1、-3およびIL-6発現の抑制にHA合成の変化が必要であるか否かを調べるため、4-MUによるHA合成の減少を補うように、外因性HA(1.0mg/ml)を培養液に添加した。外因性HA添加を行っても4-MUによる抑制効果はキャンセルされなかった(図3)。細胞内代謝はコントロールでは好気性解糖系優位のATP産生であったが、IL-1β刺激により嫌気性解糖系優位のATP産生となった。IL-1β刺激により亢進した嫌気性解糖系優位のATP産生は4-MUの投与により抑制された。培養液中の乳酸に関しても、IL-1βの刺激によりコントロールに比べて培養液中の乳酸放出が促進され、4-MUで有意に抑制された(図4)。

【考察】
膝OAの関節液中に放出されたMMPは軟骨だけでなく、半月板や靭帯などの関節内組織にも拡散し、さらなる変性を引き起こすと考えられる。いくつかの研究では、MMPレベルの上昇と半月板の変性との間に関連性があると報告されている。しかし、膝の靭帯細胞に対するサイトカインや酵素の炎症作用を報告した研究は少ない。本研究では、ACL由来細胞において、IL-1βによって誘導されるMMP発現亢進に対する4-MUの抑制効果を示した。また、ACL由来細胞では、IL-1β刺激によってIL-6の発現が亢進されることがわかった。IL-6は軟骨変性の原因となる主要な炎症性サイトカインの一つである。IL-6はACL損傷を受けた膝関節液やOAの膝関節液で上昇し、軟骨細胞に様々な異化因子を誘導することが報告されている。IL-6の阻害がヒトOA軟骨細胞におけるIL-1β誘導性MMP-3およびMMP-13の発現を抑制する報告もある。ACLの変性は、少なくとも部分的には靭帯細胞におけるIL-6の発現によって引き起こされている可能性があり、4-MUは靭帯細胞における炎症性メディエーターの発現を抑制することができると考えられた。

4-MUはHA合成阻害剤として多くの研究に用いられてきた。4-MUによるHA合成阻害の機序には、4-MU-グルクロン酸(GlcUA)糖鎖の形成が関与しており、その結果、細胞内のUDP-GlcUAが減少することになる。以前、我々は軟骨細胞における4-MUの抗炎症作用を報告したが、これはHA合成阻害とは独立して作用するものであった。本研究では、ACL由来細胞においてHAが合成され、その合成量はIL-1β刺激によって亢進し、4-MUによりHA合成の亢進は阻害された。4-MUによるMMPとIL-6の発現抑制効果がHA合成阻害依存的であるかどうかを調べるため、4-MU投与と同時に1.0mg/mlの外因性HAを添加した。しかし、HAの添加は4-MUによるターゲット遺伝子の抑制効果を減弱させなかった。これらの結果から、ACL由来細胞の炎症反応に対する4-MUの抑制効果は、HA合成阻害非依存的に作用することが明らかになった。

近年、OAを含むいくつかの慢性疾患において、細胞の代謝変化が起こることが示唆されている。OAの病因には、嫌気性解糖系亢進への代謝変化が関与していることが報告されており、嫌気性解糖系の亢進は炎症性疾患の新たな治療標的となり得る。そこで、4-MUの効果のメカニズムを解明するために、ACL由来細胞において細胞内代謝に着目し、IL-1βにて嫌気性解糖系への依存性が亢進した代謝を4-MUが効果的に抑制することを確認した。また、嫌気性解糖系の代謝産物であるL-乳酸を培養液中で評価したところ、IL-1βによってその産生が亢進し、4-MUによって抑制されることを確認した。嫌気性解糖系を抑制すると、ミトコンドリア呼吸が二次的に促進されることが明らかになった。このような嫌気性解糖系抑制のような細胞代謝の変化は、4-MUによって細胞内のUDP-GlcUAが減少することに起因すると考えられる。

この研究のLimitationとしてACL由来の細胞が均質な集団であることが確認できなかった点が挙げられる。この細胞集団には滑膜細胞と靭帯細胞の両方が含まれている可能性がある。しかし、ACL由来の細胞を用いた先行研究のほとんどは、今回使用した方法と同様の方法で細胞を分離している。また、OA環境下での4-MU効果を検討するため、ACL由来細胞とACL組織はOA膝から採取した。したがって、観察された4-MU効果は、OAのACL由来細胞に限定される可能性がある。

【結論】
本研究では、4-MUがOA-ACL由来細胞において、IL-1βによるMMP-1、MMP-3、IL-6の発現亢進を抑制することを明らかにした。4-MUは軟骨細胞だけでなく、膝の靭帯に対しても抗炎症作用を示すことから、膝OAの治療に有効である。

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