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Hyaluronan promotes TRPV4-induced chondrogenesis in ATDC5 cells

Ogawa, Yoshikazu 小川, 義和 名古屋大学

2020.05.14

概要

【緒言】
　ヒアルロン酸はglucuronic acidとN-acetylglucosamineの2糖反復構造により構成される細胞外基質glycosaminoglycanである。ヒアルロン酸が軟骨組織に重要な細胞外基質であることは以前から多数報告されている。ヒアルロン酸は軟骨細胞の保護、軟骨分化誘導、軟骨組織の恒常性維持などに大いに関与しておりヒアルロン酸の膝関節内注射により軟骨組織の容量が増大するという論文もある。ヒアルロン酸の主要な受容体はICAM－1とCD44であることが過去に報告されている。一方、非選択性陽イオンチャネルであるTRPV4が機械的負荷受容体および浸透圧受容体として軟骨分化に重要な役割を果たしていることが近年明らかになってきた。このようにヒアルロン酸、TRPV4は共に軟骨分化過程において非常に重要なものであるが過去に両者の関連性を報告した論文はない。今回我々は軟骨分化過程におけるヒアルロン酸、その受容体であるICAM－1、CD44とTRPV4との関連性を調べた。

【対象および方法】
　今回の実験では軟骨分化に関する実験で一般的に用いられているマウス奇形腫由来の細胞株であるATDC5を使用した。細胞は2日間培養後に1%インスリンを添加し軟骨分化を誘導、48時間後にTRPV4活性化刺激を開始した。TRPV4の活性化には特異的アゴニストのGSK1016790Aを用いた。様々な濃度、時間で軟骨分化代謝マーカー発現を調査した。細胞外基質からヒアルロン酸を除去する実験系ではTRPV4活性化の前にヒアルロン酸特異的分解酵素であるStreptomyces由来のヒアルロニダーゼによる12時間の前処置を行った。ヒアルロン酸の受容体であるICAM－1、CD44の作用を調べる実験系では各々の中和抗体による前処置をTRPV4活性化の前に１時間行いICAM－1、CD44の作用を抑制した。軟骨分化代謝マーカーであるSOX9、Aggrecanの発現をmRNA発現はreal-time PCR法、タンパク発現はWestern blotting法で調査した。real-time PCR法では標的遺伝子のmRNA発現変化量をGAPDHを基準にして計算した。Western blotting法ではβ-actinを基準に用いた。

【結果】
　GSK1016790AによるTRPV4機能の活性化によって軟骨分化代謝マーカーであるSOX9やAggrecanの発現が濃度および時間依存的に上昇した(Fig1)。SOX9の発現はGSK1016790A濃度100nM、刺激後6時間での上昇が大きく以後SOX9のmRNA採取は同条件で行った。Aggrecanの発現はGSK1016790A濃度100ｎM、刺激後24時間での上昇が大きく以後AggrecanのmRNA採取は同条件で行った。ヒアルロニダーゼで細胞外基質ヒアルロン酸を除去するとTRPV4経由のSOX9、AggrecanのmRNA発現上昇が有意に抑制された。ヒアルロニダーゼ処理後に再度ヒアルロン酸を添加するとSOX9、AggrecanのmRNA発現上昇がみられた(Fig2)。この現象はタンパクでも同様であった。ICAM－1、CD44の作用を中和抗体で抑制するとTRPV4活性化によるSOX9、AggrecanのmRNA発現上昇効果が抑制された。ICAM－1抑制の方がCD44抑制よりもSOX9、Aggrecanの発現抑制効果が大きい傾向があった(Fig3)。タンパクでも同様の所見であった。

【考察】
　今回の実験で機械的負荷受容体であるTRPV4の機能活性化が軟骨分化を促進すること、その過程にはヒアルロン酸が必要であること、ヒアルロン酸はその受容体であるICAM－1とCD44を介して作用していることが判明した。ヒアルロン酸とTRPV4との相互作用の詳細な分子生物学的機序は不明だが過去の文献からRhoタンパクfamilyを介して相互作用を行っている可能性が示唆されている。またICAM－1とCD44は軟骨分化経路において別々の作用点で機能していることが過去に報告されている。ICAM－1とCD44が軟骨分化過程において相加的に作用している可能性が示唆されるがその詳細な機序の解明は今後の検討課題である。今回の実験のlimitationの一つとして3次元での細胞構成が困難で2次元の細胞構成による実験であることがあげられる。

【結語】
　ATDC5細胞株を用いた実験で機械的負荷受容体であるTRPV4の活性化により軟骨分化が促進された。この実験系ではヒアルロン酸がTRPV4誘導の軟骨分化において必須であった。ヒアルロン酸の作用にはその受容体であるICAM－1とCD44が各々部分的に関与していたがICAM－1の関与がより大きい傾向であった。今回の発見は生体での軟骨分化過程におけるヒアルロン酸と機械的負荷との相互作用の解明に役立つと考えられた。

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