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新規カニクイザル栄養膜幹細胞株の樹立とその分化能解析

松本, 翔馬 東京大学 DOI:10.15083/0002004959

2022.06.22

概要

胎盤は母体と胎子とを繋ぐ臓器であり、主に栄養の供給やガス交換、不要物の排出などを行う。栄養膜幹細胞(㼀㻿細胞)は胎盤を構成するすべての栄養膜細胞へと分化可能であり、マウス胚盤胞より初めて樹立された。マウス㼀㻿細胞と同様の培養条件では、ヒト㼀㻿細胞を樹立することができなかったが、近年、EGFやWntシグナル活性化剤などを添加することで、ヒト胚盤胞由来の㼀㻿細胞も樹立された。これら㼀㻿細胞は妊娠初期における胎盤形成の知見を得る上で、極めて有用なツールとなる。

私は修士論文で、マウスと同様にFGF4により増殖が促進されるカニクイザル胚盤胞由来栄養膜細胞(Cy㼀㻾F)の樹立を報告した。ヒトおよびマウス㼀㻿細胞に加え、ヒト以外の霊長類㼀㻿細胞と比較解析を行うことで、霊長類、げっ歯類間での胎盤形成メカニズムの違いについて解析することが可能となる。そこで本論文では、Cy㼀㻾Fの分化能の有無をより詳細に解析することとした。また、ヒト㼀㻿細胞はCDX2やEOME㻿などの、マウス㼀㻿細胞の分化能維持に必須とされる遺伝子を発現していないことが報告されている。このことから、マウス㼀㻿細胞とは異なる転写因子ネットワークが分化能を維持していると考えられるが、その全容は未解明である。この課題の解明は霊長類に共通した胎盤形成メカニズムを把握する上で重要であり、将来的にヒトと近縁種であるカニクイザルを用いた臨床応用のための基礎研究へと繋がることが期待される。

第1章では霊長類栄養膜サブタイプである、絨毛性ゴナドトロピン(CG)を分泌する多核の合胞体栄養膜細胞(㻿㼀B)、および浸潤能をもつ絨毛外栄養膜細胞(EV㼀)への分化能解析を行なった。Cy㼀㻾Fを、ヒト栄養膜細胞の㻿㼀Bへの分化を誘導することが知られているdbcAMPの存在下で培養し、㻾NA-seqにより網羅的な遺伝子発現解析を行なった結果、胎盤形成や分化に関わる遺伝子の発現が上昇することが明らかになり、㻿㼀B形成に関わる細胞融合、EV㼀への分化に関わる上皮間葉転換関連の遺伝子セットの発現も上昇することがわかった。またdbcAMP添加により、Cy㼀㻾Fは細胞融合を介し、CGを発現する多核の細胞を形成することが示された。さらに浸潤能に関わるMMP2の活性レベルも上昇し、浸潤能を獲得した細胞の出現も上昇した。これらの結果から、Cy㼀㻾Fは㻿㼀BおよびEV㼀への分化能を有する未分化な細胞であることが示された。続いて、Cy㼀㻾Fが胚盤胞期の栄養外胚葉(㼀E)と類似の性質を有する可能性があるか、マウス8細胞期胚を用いた異種間キメラ解析で検討した。解析の結果、使用した2ラインのCy㼀㻾Fはいずれもマウス初期胚とキメラ胚を形成し、胚盤胞期まで発生が進むことが明らかになった。また、Cy㼀㻾Fは胚盤胞期において内部細胞塊(ICM)には局在せず、㼀Eにのみ寄与した。以上の結果から、Cy㼀㻾Fは㻿㼀BおよびEV㼀のいずれの栄養膜サブタイプへも分化可能な細胞であり、㼀Eに寄与しうる性質を持つことが明らかになった。これらを受け、私は、Cy㼀㻾Fは栄養膜幹細胞(macaque trophoblast stem cell, mac㼀㻿細胞)株であると提唱した。

第1章においてdbcAMP添加は㻿㼀BおよびEV㼀への分化を誘導したが、その誘導効率は高いとは言いがたい。霊長類における胎盤形成メカニズムの解明に利用するツールとしては、㻿㼀B、EV㼀それぞれの分化を特異的に誘導できる条件の確立が望まれる。そこで第2章では、mac㼀㻿細胞を用いた分化誘導条件の検討を行なった。まずは、ヒト㼀㻿細胞のEV㼀への分化誘導時に用いられる化合物がmac㼀㻿細胞に及ぼす影響について検討したが、EV㼀マーカーの著しい発現上昇は確認できなかった。このことから、カニクイザル栄養膜細胞においてはEV㼀の分化誘導に重要な因子がヒトと異なることが示唆された。続いて、ヒト㼀㻿細胞の分化能維持に重要であることが示唆されているシグナル経路に着目し、mac㼀㻿細胞への影響を解析した。その結果、特定のシグナル経路を活性化させることでmac㼀㻿細胞の㻿㼀Bへの分化能が亢進することが示された。

第3章では、mac㼀㻿細胞を用いることで霊長類栄養膜細胞の分化能維持に働く転写因子候補の同定を試みた。mac㼀㻿細胞の㻾NA-seqデータとカニクイザル胚盤胞の㼀Eにおけるシングルセル㻾NA-seqデータとを比較し、未分化状態にあるmac㼀㻿細胞と㼀Eに共通して高発現している転写因子の抽出を行なったところ、7つの転写因子が抽出された。これらの転写因子がmac㼀㻿細胞で高発現する遺伝子の発現制御を行なっている可能性についてinsilico解析により予測すると、いずれの転写因子の結合予測配列も、mac㼀㻿細胞で高発現している遺伝子の転写開始点から200bp上流以内に、全遺伝子領域に比べより高頻度で存在することが明らかになった。7転写因子のうち、霊長類栄養膜細胞における機能が報告されていない2遺伝子に着目し、C㻾I㻿P㻾-Cas9システムによりノックアウト株を作製し、その表現型を解析した。その結果、ノックアウト株においては未分化マーカー遺伝子の発現量の減少と分化マーカー遺伝子の発現の増加、および細胞増殖率の減少も認められ、着目した2遺伝子がmac㼀㻿細胞の維持に重要であることが示された。

以上、本研究により、カニクイザル胚盤胞より樹立した細胞株が㻿㼀B、EV㼀双方向への分化能を持ち、異種間キメラ胚において㼀Eへ寄与可能な栄養膜幹細胞であることが示された。さらに、特定のシグナル経路の活性化が、mac㼀㻿細胞の㻿㼀Bへの分化に重要であることが示唆された。また、マウス㼀㻿細胞におけるCDX2やELF5に代わる、霊長類栄養膜幹細胞の主要転写因子候補として7つの転写因子が抽出された。特に栄養膜細胞での機能についての報告がない2遺伝子の重要性が示され、これら2遺伝子を含む、転写因子ネットワークが㼀㻿細胞の維持に重要である可能性も示された。以上、カニクイザル栄養膜幹細胞の分化能維持や分化制御に関わる因子が新たに同定され、mac㼀㻿細胞は霊長類栄養膜細胞のinvitroモデルとして非常に強力なツールとなることが示された。今後、ヒトにおいては倫理的な障壁から実施困難な解析が、カニクイザルを用いることで可能となり、霊長類の妊娠初期における胎盤形成メカニズムのさらなる解明が期待される。

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