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大学・研究所にある論文を検索できる 「Rapid Identification of Candida Species in Candidemia Directly from Blood Samples Using Imperfect Match Probes」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。

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Rapid Identification of Candida Species in Candidemia Directly from Blood Samples Using Imperfect Match Probes

東 祥嗣 富山大学

2020.09.28

概要

〔目的〕
カンジダ血症は院内菌血症の原因微生物として頻度が高い一方で細菌と比較して長い培養時間を要するため早期診断,早期治療は容易ではない. また菌種により薬剤感受性が異なるため,迅速同定は治療方法の早期決定に加え患者予後に直結すると思われる. 細菌による菌血症の原因同定法として,複数のprimer setを用いて得られたTm値を組み合わせて同定するTm mapping法が報告されている. しかしながらカンジダ属は真核生物のため,ヒト検体で使用できるuniversal primerを複数作成するのは困難である. このような解決すべき課題に対し,1つのuniversal primer setに加え不完全一致配列のprobe (IM Q-probe)を組み合わせることにより培養過程を経ず血液検体から直接カンジダ血症の主要8菌種を同定する方法の開発を試みた.

〔方法並びに成績〕
1セットのuniversal primerと消光probeであるQ-probeを組み合わせることで,複数のTm値を 獲得することを可能とした.カンジダ8菌種について,それぞれ塩基ミスマッチ数が異なり,かつmutant strainsに依らず塩基配列が一定になるよう,DNA DATA BANKでmutant strainsの塩基配列で確認し,1つの増幅産物の中に3種類のIM Q-probeを設計した.IM Q-probeとPCRで得られた増幅産物によるTm値は,IM Q-probeと標的DNA領域とのマッチした塩基数,塩基配列,および GC%により規定される.そのため3つのTm値の組み合わせは菌種特異的なものとなった.菌種は Tm値の組み合わせをデータベースと比較することで判定した.具体的には得られた3つのTm値を 3次元の1点の位置として,データベース中の既知のカンジダ菌との2点間の距離を“Difference Value (D)”として表す.この値がゼロに近い程,検出菌がデータベース中のカンジダ菌種と 一致することを意味する.施行内誤差が最大で±0.25℃存在したため,診断基準は0.0 ≤ D ≤ 0.41とした.本法の同定感度は1.2 CFU of C. albicans per PCR tubeであった.精度評価として先ず臨床検体コロニーから検出されたカンジダ8菌種,34株のDNAで評価し,全株においてシークエンス解析結果と一致した.次にカンジダ8菌種の菌株(2×102 CFU)を健常者血液(全血2 mL)に混入したカンジダ血症疑似血液検体を作成し,本法を用いてカンジダ菌種の検出・同定を行った.その結果,カンジダ8菌種全てにおいて正確に同定することが出来た.最後にカンジダ血症患者の血液検体16検体(3菌種)を用い,本法でカンジダ菌種の迅速同定を行った結果, 16検体全てにおいて採血後約3.5時間でカンジダ菌種を正確に検出・同定することができた.

〔総括〕
採血から約3.5時間でカンジダ血症の主要8菌種を検出・同定できる新たな遺伝子検査法を開発した. 本法は培養検査と比較して迅速診断が可能であり,より早期に適切な抗真菌薬の選択が可能となりうる. 近年,医療の高度化や社会の高齢化のためcomprom ised hostは増加してきており,それに伴いカンジダ血症による敗血症も増加している.そのため本法がカンジダ血症に対する治療成績向上に役立てばと考えている.

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参考文献

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