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植物ホルモン・ブラシノステロイドのマスター転写因子のDNA結合特異性の構造基盤

野﨑, 翔平 東京大学 DOI:10.15083/0002002060

2021.10.04

概要

1.背景と目的
ブラシノステロイド(brassinosteroid; BR)は植物に普遍的に存在する植物ホルモンであり,植物において葉や茎などの器官成長促進,植物細胞分裂・伸長・分化の制御,受精促進,葉緑体制御から,植物の自然免疫やストレス耐性向上などの環境応答機構にも及ぶ多岐にわたる生理活性を有する.BRの生理作用には,BR情報伝達のマスター転写因子BZRファミリー転写因子群によって引き起こされる特異的かつ多様な遺伝子応答が不可欠である.BZR転写因子は植物間で極めて高度に保存されるDNA結合ドメインを介して,標的遺伝子のプロモーター領域上の特定の塩基配列を特異的に認識する.BZR転写因子によって直接制御されるBR応答性遺伝子のプロモーター上にはG-box配列(5’-CACGTG-3’)やBR応答配列(5’-CGTGC/TG-3’)が多く存在することがわかっていたが,BZR転写因子のDNA結合特異性はこれまで十分に理解されていなかった.そこで本研究では生化学的解析および構造生物学的手法を用いて,BZR転写因子のDNA結合特異性を詳細に理解することを目的とした.

2.BZR転写因子およびbHLH転写因子の生化学的解析
本研究では,BZR転写因子のDNA結合ドメインが,真核生物で広く保存されるヘリックス・ループ・ヘリックス(basichelix-loop-helix; bHLH)ファミリー転写因子(典型的なGbox配列結合型)と類似の二次構造および塩基配列認識モチーフをもつことに着目した.ゲルシフトアッセイ(EMSA)と等温滴定カロリメトリー(ITC)を用いたinvitro解析の結果,BZR転写因子はG-box配列(5’-CACGTG-3’)中のC1A2塩基に対する特異性が典型的bHLH転写因子に比べて緩められていることがわかった.またゲル濾過クロマトグラフィーとITCの結果から,BZR転写因子は一般的なbHLH転写因子と同様に溶液中でホモ二量体として存在し,1つのコア塩基配列に対して二分子で認識することも明らかになった.

3.BIL1/BZR1と標的DNAの複合体のX線結晶構造解析
BZR転写因子のDNA結合特異性を原子レベルで理解するために,シロイヌナズナにおけるBRのマスター転写因子BIL1/BZR1と標的DNAとの複合体のX線結晶構造解析を行った.結晶化においては,結晶化促進タグとしてマルトース結合タンパク質(MBP)をBIL1/BZR1に融合させたキメラタンパク質を利用した.MBPとBIL1/BZR1を繋ぐリンカーの長さ,および標的DNAの長さ・形状・塩基配列を検討することで,高分解のX線回折データを与える結晶の作製に成功した.構造既知のMBPを鋳型にした分子置換法により位相を決定し構造解析を行うことで,分解能2.17ÅのMBP融合BIL1/BZR1および標的DNAとの複合体の立体構造の決定に至った.これは植物間で高度に保存されているBZR転写因子において初めて解明された立体構造である.

4.BIL1/BZR1の標的DNA認識の構造基盤
BIL1/BZR1の構造はbHLH転写因子と同様にヘリックス・ループ・ヘリックスを基盤としたホモ二量体構造を形成し,αヘリックスを形成した塩基性領域(DNA認識ヘリックス)がDNAの主溝にはまり込む形でDNAに結合していた(図1).一方BIL1/BZR1においてはbHLH転写因子とは異なり,短いヘリックス2のC末端側にβヘアピン構造が形成されていた.この構造はBIL1/BZR1の二量体界面に位置することで,DNA認識ヘリックス間の角度をbHLH転写因子よりも約20°も広げていることがわかった(図1).

BIL1/BZR1の塩基認識についてG-box配列(5’-CACGTG-3’)を含む複合体構造を調べたところ,塩基認識に係わる残基はbHLH転写因子と同様にDNA認識ヘリックス上のGlu(i),Arg(i+3),Arg(i+4)であることがわかった.一方,BIL1/BZR1とbHLH転写因子の構造比較では,Arg(i+4)によるG4(C3の相補塩基)の認識様式は両者で共通であるのに対し,Glu(i)によるC1A2(T5G6の相補塩基)の認識様式はGlu(i)の配向の変化により異なっていた.BIL1/BZR1のGlu(i)はbHLH転写因子と同様にArg(i+3)およびDNAを交えた相互作用ネットワークにより固定されてたが,ネットワーク形成様式やArg(i+3)が相互作用するDNAのリン酸基が異なっていることがわかった(図2).以上のBIL1/BZR1とbHLH転写因子間での構造的な違いは,DNAとの相互作用に係わる残基の変異体や多様な塩基配列のDNAを用いた詳細な比較解析の結果によって裏付けられた.興味深いことに,DNAのリン酸基の位置はBIL1/BZR1の大きく傾いたヘリックスとそれに伴うループの特徴的な配置によって空間的に制限されていた.以上の構造的知見は,BIL1/BZR1の二量体形成領域におけるβヘアピン構造が,大きく傾いたヘリックスを通じてDNAの形状に制約を与え,DNAとの相互作用ネットワークの形成様式を変化させることにより,Glu(i)のC1A2に対する特異的認識を緩めていることを強く示唆している.またBIL1/BZR1の二量体形成やDNAとの相互作用に係わる残基はいずれも,高等植物のみならずコケやシダを含む陸上植物のBZR転写因子型DNA結合ドメインにおいても高度に保存されており,BZR転写因子型DNA結合ドメインの最も重要な特徴であると考えられる(図1,2).

5.BIL1/BZR1のコア塩基外の周辺配列に対するDNA結合特異性の分子機構
本研究では,BIL1/BZR1がG-box配列を含めたコア塩基配列だけではなくその周辺配列に対してもDNA結合特異性をもつことを見出した.転写因子を含めたDNA結合タンパク質は,特定のDNA領域を特異的に認識するために主に2通りの方法を用いる.1つは塩基の化学的性質を直接的に読み取る方法,そしてもう1つは塩基配列依存的に変化するDNAのコンフォメーションを読み取る方法である.BIL1/BZR1も同様のDNA結合特異性を有すると仮説を立て,DNAとの相互作用に直接的または間接的に係わる残基の変異体を用いて特異性に寄与する残基の特定を行った.変異体の解析の結果,Glu37(i)とAsp64が周辺塩基配列に対する特異性に関与していることが示唆された.Glu(i)およびAsp64はいずれもDNAとの相互作用ネットワークの強化に必要な残基である.この相互作用ネットワークでは,Glu(i)およびAsp64残基との塩橋によって固定される2つのArg残基Arg(i‒1)およびArg(i+3)がコア配列周辺に位置するDNAリン酸基P‒1およびP0をそれぞれ直接的に認識する(図2).これらのリン酸基の位置は塩基配列依存的に変化しうるため,BIL1/BZR1を交えた相互作用ネットワーク内の水素結合・塩橋パターンに変化が生じ,結合自由エネルギーすなわちDNA結合親和力に強弱が生まれていると考察される.

6.総括
生体内では同一の塩基配列モチーフが数多くの転写因子によって認識されており,これが生命現象の複雑さを生み出す一因になっている.G-box配列はこのような塩基配列の1つであり,植物のゲノム上に多数点在しbHLH転写因子を含むさまざまなファミリーの転写因子に認識される.本研究における解析により,BZR転写因子は典型的なbHLH転写因子と同様にG-box配列結合型の転写因子であり,bHLH転写因子とは競合しうる関係にあることを明らかにした.また,BZR転写因子は高度に保存される二量体構造とDNAとの相互作用ネットワークを利用して,G-box配列に対する塩基認識特異性を緩めており,さらにBZR転写因子特有の新規な分子機構で周辺塩基配列への特異性を生み出していることがわかった.BR情報伝達を担うBZR転写因子はbHLH転写因子と共通の塩基認識モチーフを有しながら,非典型な二量体形成様式をとることにより,bHLH転写因子が認識する遺伝子プロモーターだけでなく,bHLH転写因子が認識しづらい遺伝子プロモーターの認識も可能にしていると推測される.本研究で明らかにしたBZR転写因子のDNA結合特異性の構造基盤は,BR応答遺伝子の多様さを生み出す仕組みそのものであるといえ,多様な生理機能を制御するBR情報伝達の理解に大きく貢献する知見と考えられる.

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参考文献

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