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PPRタンパク質による葉緑体遺伝子の翻訳制御

東, 遥香 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23045

2021.03.23

概要

PPRタンパク質は、配列特異的なRNA結合活性を有し、植物細胞では、葉緑体やミトコンドリアで、転写後のRNAの成熟化や翻訳の活性化に関わる。PGR3(PROTONGRADIENT REGULATION 3)は、シロイヌナズナで見つかったPサブファミリーのPPRタンパク質であり、petLオペロンRNAの安定化とpetL遺伝子の翻訳に必須である。さらにPGR3は、葉緑体NDH複合体の蓄積に必須であるが、どのndh遺伝子の発現に必須であるかは、明らかにされていなかった。

東氏は、リボソームプロファイリングの技術を導入し、3つあるpgr3の変異アレルにおいて、葉緑体遺伝子の発現異常をゲノムレベルで調べた。その結果、既知の機能に加えて、PGR3は、ndhG遺伝子の翻訳に必須であることが明らかになった。pgr3-2変異株では、変異型PGR3は、petL遺伝子の5’ UTRに結合できないが、ndhG遺伝子の翻訳活性が上昇しており、標的に対してPGR3は飽和しておらず、標的間で競合が起きていることが明らかになった。

in vivoで、PGR3が標的RNAに結合している証拠を得るため、PGR3の結合サイトに対応する短いRNA(PPRフットプリント)をRNAゲルブロット解析で検出した。野生株では、それぞれのフットプリントRNAが検出されたが、変異株では、検出されなかった。リボソームプロファイリングの結果と合致し、PGR3は、petLとndhGの5’ UTRに結合することが示された。

PGR3は、27のPPRモチーフより成る。pgr3-1とpgr3-2は、それぞれ15番目と13番目のPPRモチーフの4番目のスレオニンに同じイソロイシンへの変異をもつ。一方、pgr3-3では、最後の不完全なPPRモチーフの8番目のロイシンからフェニルアラニンへの置換が見られる。pgr3-3の変異は、petLとndhGの翻訳に大きな影響を与える。また、16のN末側のPPRモチーフは、petLの5’ UTRの結合とRNAの安定化に十分であり、一方、C末側の11のPPRモチーフは、翻訳の活性化に関わると考えられていた。しかしながら、各変異がRNA結合や翻訳の活性化に与える影響は、分子レベルで理解されていなかった。そこで、立体構造が明らかになっている人工PPRタンパク質の構造をもとに、PGR3の構造予測を行った。その結果、pgr3-1とpgr3-2で変異が起きているスレオニンは、一つ前のPPRモチーフの塩基選択制を決めるアミノ酸残基(6と1’)の近傍に位置し、水素結合を形成する可能性が示唆された。またpgr3-3の変異のある8番目のロイシンは、4番目のスレオニンのごく近傍に位置することが明らかになった。したがってそれぞれの変異アレルにおいて、変異が一つ前のPPRモチーフの塩基選択制に影響を及ぼす可能性が示唆された。

5’UTRに結合し、翻訳を活性化するPPRタンパク質の機能として、翻訳開始点付近に形成されるRNAの二次構造を解して、そこにリボソームを呼び込むモデルが考えられている。そこでPGR3が認識するpetLとndhGの5’ UTRの構造を予測したところ、安定な二次構造が予測された。この二次構造には、petLの場合はSD配列が、ndhGの場合は、翻訳開始コドンが含まれた。

この二次構造の翻訳に対する影響を調べるため、T7プロモーターとレポーター遺伝子の(EGFP)の間に、二次構造を形成する配列を挿入し、大腸菌のin vitro翻訳系に供した。また、二次構造の翻訳に対す影響を考慮するために、二次構造を破壊するような変異を導入したUTRも作成した。その結果、petLとndhGの5’ UTRの二次構造が、レポーター遺伝子の翻訳効率を大きく減少させることを明らかにした。さらに、そこに大腸菌で発現させた組換えPGR3タンパク質を加えると、翻訳効率を上昇させることを明らかにした。続いて、PGR3の配列からPPRコード(PPRモチーフのアミノ酸配列と認識する塩基の対応)を用いて、結合配列を予測したところ、N末側の16のPPRモチーフは、二次構造を形成する配列の上流の一本鎖部分、そしてC末側の11のPPRモチーフは、二次構造を形成する配列を認識することが示唆された。この結果は、PPRフットプリントの位置と矛盾しない。

以上の結果から、東氏は、PGR3がN末側領域で標的配列を認識し、petLの場合はRNAを安定化し、さらにC末側の領域で下流の配列と相互作用することで、二次構造の形成を阻害し、そこにリボソームを呼び込むモデルを提唱した。

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参考文献

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