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新薬創出におけるラットを用いた新たな骨毒性評価法の確立に関する組織学的研究

野口, ちひろ 東京大学 DOI:10.15083/0002008261

2023.12.27

概要





















野口ちひろ

医薬品の研究開発において、反復投与毒性試験は非臨床安全性試験として重要な役割を
担っている。その中でも病理組織学的検査は、臓器毒性を評価する方法として検出感度が高
いことから、様々な臓器について実施されてきた。しかしながら、骨は種類や発達段階によ
って静止軟骨細胞層、増殖軟骨細胞層(増殖帯)および肥大軟骨細胞層(肥大帯)の3層か
らなる成長板の閉鎖時期も異なるため、他の臓器と比較して骨毒性についての研究報告は
少なく、骨毒性を判断する上での基準も十分に構築されているとは言えない。そこで、本研
究ではまず正常なラットにおける成長板を中心とした骨の成長に伴う組織学的特徴を明ら
かにし、その上で既に臨床において骨関連有害事象を引き起こすことが知られている薬剤
を、様々な条件でラットに投与した際の大腿骨、脛骨、上腕骨および胸骨に及ぼす病理組織
学的変化を明らかにすることにより、反復投与毒性試験における精度の高い骨毒性評価方
法について確立することを目的としている。
本論文は 6 章からなり、第 1 章では、研究の背景および目的を述べている。
第 2 章では、正常ラットの骨における成長板を中心とした週齢による組織学的特徴につ
いて検討した。幼若動物(投与開始時 2 週齢)
、若齢動物(投与開始時 6 週齢)および成熟
動物(投与開始時 28 週齢)に薬剤投与の際に溶媒として使用される 0.5%メチルセルロー
ス 400(MC400)を 5 ml/kg の用量で 14 日間経口投与した際の成長板を組織学的に評価した
結果、成長板の増殖帯と肥大帯の幅はほとんどの骨で成長に伴って減少することが明らか
になった。その要因として成長に伴う軟骨細胞数の減少と増殖帯軟骨細胞における
Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)陽性細胞率の低下が関与しているものと考え
られた。一方、成熟動物については骨の種類による上記指標に対する明確な差異が認められ
なかったが、幼若動物と若齢動物においては成長板の閉鎖時期における種類の骨では成長
板の増殖帯と肥大帯の幅が狭小化し軟骨細胞数は減少することが明らかとなった。したが
って、ラットを用いて非臨床安全性試験で骨毒性を評価するためには、ラットの週齢と評価
する骨の種類を考慮する必要性があり、その上で成長板の病理組織変化に及ぼす影響を判
断することが重要であると考えられた。
第 3 章では、臨床で骨関連有害事象を引き起こす薬剤として知られている抗悪性腫瘍薬
の 5-フルオロウラシル(5FU:12, 15, 18 mg/kg/日)を 14 日間経口投与した際の骨毒性に
ついて、5-FU 投与による摂餌量の減少と同程度に設定した制限給餌の影響も含めて検討し
た。摂餌量は対照群と比較して 5-FU により用量依存的に減少し(25~53%)増体も抑制され

た。病理組織学的には顕著な変化は認められなかったが、対照群と比較して 5-FU 投与によ
り骨の成長板の増殖帯幅(36~44%)や増殖帯軟骨細胞数(36~50%)の減少が認められた。
制限給餌による変化も同程度だったことから、5-FU 投与により認められた変化は摂餌量な
らびに増体の抑制に伴う二次的な影響であると考えられた。したがって、ラットを用いた非
臨床安全性試験において、対照群と比較して摂餌量の減少や体重に顕著な影響がある際に
は、薬剤の直接作用以外の可能性を考慮した上で骨毒性を評価し判断することが重要であ
ると考えられた。
第 4 章では、5FU よりも成長板への影響がより強く、臨床で骨関連有害事象を引き起こす
薬剤として知られている副腎皮質ステロイドであるデキサメタゾン(DEX:0.3 mg/kg/日)を
幼若、若齢、成熟ラットに 14 日間経口投与し、薬剤の投与を開始する週齢の違いが骨毒性
に及ぼす影響を病理組織学的に検討した。その結果、幼若と成熟動物に比較して若齢動物の
骨において、対照群と比較して DEX 投与により成長板の増殖帯幅と肥大帯幅は狭く軟骨細
胞数は少ないことが明らかになった。また、成長板の軟骨細胞増殖活性についても週齢によ
る差が明らかとなり、胸骨における DEX 投与の影響が何れの週齢においても最も顕著に認
められた。したがって、成長板を含む骨への骨毒性を評価するためには薬剤の投与開始時期
を考慮する必要があり、若齢動物での投与開始と胸骨における変化を評価することが有効
であると考えられた。
第 5 章では、老齢ラットにおける骨毒性の報告がほとんどないことから、抗悪性腫瘍薬で
あり DEX よりも老齢ラットに対する骨毒性が高いと考えられるドキソルビシン(DOX: 15
mg/m2 体表面積)を隔週毎に計 5 回尾静脈投与した際の病理組織学的な影響について検討し
た。ラットの骨端閉鎖時期は骨によって異なり、成長板閉鎖の期間が比較的短い急性骨化型、
比較的長い期間を必要とする遅延骨化型および成長板が閉鎖されず終生成長板が認められ
る不完全骨化型の3つに分類されることが知られている。老齢ラットでは何れの骨におい
ても成長板の軟骨細胞増殖活性は消失していたものの、成長板の閉鎖が遅い近位脛骨と近
位上腕骨では DOX 投与により成長板は菲薄化することが認められた。したがって、老齢ラッ
トで骨毒性を評価する際には、成長板組織が比較的保持されて残存している近位脛骨や近
位上腕骨を用いて薬剤投与の影響を評価することが可能であると考えられた。
第 6 章では、得られた知見に関して総合考察がなされている。
本研究では、非臨床安全性試験において実験動物として使用されるラットにおける、反復
投与毒性試験における精度の高い骨毒性評価方法について、正常な骨の発達に伴う組織学
的変化を明らかにした上で、薬剤による病理組織学的な変化による毒性の評価基準を確立
している。本研究で得られた結果は、医薬品の開発研究において薬剤性骨疾患を検知しうる
病理組織学的評価法として有用であり、基礎疾患の治療の際に薬剤性骨疾患の発生を防ぎ
患者のクオリティ・オブ・ライフの向上につながるものと考えられた。これらの研究成果は、
学術上応用上寄与するところが少なくない。よって、審査委員一同は本論文が博士(獣医学)
の学位論文として価値あるものと認めた。

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