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Thymidylate synthase inhibitor raltitrexed can induce high levels of DNA damage in MYCN-amplified neuroblastoma cells

山下, 顕 名古屋大学

2021.04.23

概要

【緒言】
　神経堤細胞に由来する神経内分泌腫瘍である神経芽腫は、日本では年間約200例が報告されており、小児期にできる固形腫瘍の中で白血病、脳腫瘍に次いで多い。国際神経芽腫リスクグループ病期分類システムは、治療前のリスク分類のための新しい病期分類システムとして提案され、予後因子、例えば診断時の年齢、腫瘍組織学、遺伝的異常などと組み合わせることにより、神経芽腫の患者を4つのグループ（超低リスク、低リスク、中間リスク、高リスク）に分類できる。MYCファミリー遺伝子の一つであるMYCN遺伝子の増幅（100-200コピー）は、高リスクグループの特徴であり、大規模な患者コホートにおける5年無イベント生存率は29％であることが報告されている。つまり、MYCN遺伝子の増幅は、神経芽腫における予後不良と強く相関しており、MYCN増幅型神経芽腫の克服こそが最重要課題といえる。
　現在、代謝拮抗剤である5-フルオロウラシルやメトトレキサートは消化器がんや白血病などに広く使用されているが、これまで神経芽腫に対する有効性は十分に検討されていなかった。そこで本研究ではMYCN増幅型神経芽腫細胞株に対する代謝拮抗剤の有効性及びMYCN増幅の有無による代謝拮抗剤の作用の違いの原因を究明する。

【方法】
　MYCN増幅型とMYCN正常型の神経芽腫細胞株を96wellプレートに播種し、0.01nMから100μMの代謝拮抗剤（メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド「以下、RTXという」）及び現在治療に用いられている薬剤（エトポシド、シスプラチン、カルボプラチン）で処理した。3日後にアラマーブルーアッセイ法により細胞生存率を測定し、各種代謝拮抗剤に対するIC50値を算出した。
　次に、MYCN増幅型とMYCN正常型の神経芽腫細胞を用いて、代謝拮抗剤の主要なトランスポーターであるRFC（reduced folate carrier）とRTXの作用標的タンパク質であるTS（thymidylate synthase）の発現量をウェスタンブロッティング法により評価した。
　また、MYCN増幅型の神経芽腫細胞株であるIMR-32をチミジン添加培地中にて0.01nMから100μMのRTXで処理をし、3日後の細胞生存率をアラマーブルーアッセイ法により評価した。
　最後に、MYCN増幅型であるIMR-32とMYCN正常型であるSH-SY5YをRTX添加培地中で培養し、72時間後まで経時的に細胞を回収した後、細胞生存率をアラマーブルーアッセイ法により、DNA損傷マーカーの発現量をウェスタンブロッティング法により評価した。

【結果】
　試験した代謝拮抗剤のIC50値はMYCN正常型株と比較してMYCN増幅型株で低値を示す傾向が認められた（表1）。一例としてMYCN正常型株であるSH-SY5Yに対するRTXの細胞増殖抑制効果は最高濃度である100μMでも観察されずIC50値を算出できなかったが、MYCN増幅型株であるIMR-32に対するIC50値は5.7nMと極めて低い値を示した。
　また、RTXのIC50値は、現在治療に用いられている薬剤よりもSH-SY5Yでは高値を示したが、IMR-32では統計学的に有意に低値を示した。
　次に、代謝拮抗剤の主要なトランスポーターであるRFC及びRTXの作用標的タンパク質であるTSの発現量をウェスタンブロッティング法で評価した結果、MYCN増幅型とMYCN正常型の細胞株間で発現量に有意な差がないことが示された。一般に、薬剤のトランスポーターの発現量低下や作用標的タンパク質の発現量増加が薬剤耐性の主原因と考えられているが、神経芽腫細胞株において観察された代謝拮抗剤に対する感受性の違いは別の分子機構によるものであると考えられた。
　また、チミジンを添加した培地でRTXのIMR-32に対する細胞増殖抑制効果を評価した結果、3μmol/L以上のチミジンを添加することで細胞生存率が回復した。これはサルベージ経路によって培地中のチミジンがdTMPに変換されて細胞内のdTTP濃度が回復したことを示している。従って、RTXによって作用標的タンパク質であるTSの酵素機能が阻害されてdTTP濃度が低下することが細胞増殖抑制の主原因であることが明らかとなった。
　さらに、RTXによる細胞増殖抑制メカニズムを理解するために、IMR-32とSH-SY5Yを用いて、RTX処理下での各細胞株の経時的な細胞増殖率及びDNA損傷マーカーの発現量を評価した。その結果、RTXを添加することで、SH-SY5Yの細胞生存率には72時間後まで大きな影響を与えなかった一方で、IMR-32では、48時間後に細胞生存率が低下し始め、72時間後には極めて低い細胞生存率を示すことが確認された。加えて、DNA複製ストレスのマーカーであるリン酸化されたDNA損傷チェックポイントキナーゼChk1とリン酸化されたRPA（Replication protein）及び二本鎖切断のマーカーであるリン酸化されたDNA損傷チェックポイントキナーゼChk2とリン酸化されたH2AXの発現量がRTX添加後48時間以降にSH-SY5Yと比較してIMR-32で大幅に誘発されることが観察された。

【結論】
　以上の結果から、代謝拮抗剤はMYCN増幅型の神経芽腫細胞の増殖を特異的に抑制することが判明した。代謝拮抗剤の中でも特にRTXでは強力な細胞増殖抑制能が認められ、MYCN遺伝子増幅がみられる高リスク患者に対して有効な治療手段となる可能性がある。
　MYCN増幅型細胞とMYCN正常型細胞でRTXに対する感受性に違いが出たのは、RTXのトランスポーターや作用標的タンパク質の発現量が要因ではないことが確認された。一方で、各種のDNA損傷マーカーの解析結果からMYCN増幅型細胞においてRTXに対する感受性が増加したのは、MYCN増幅に起因する高いDNA複製ストレス存在下でRTX処理によりdTTP濃度が低下したことによって誘発されたDNA損傷レベルの上昇が原因であると考えられた（図1）。

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参考文献

1. Maris JM, Hogarty MD, Bagatell R, Cohn SL. Neuroblastoma. Lancet. 2007;369:2106-2120.

2. Matthay KK, Maris JM, Schleiermacher G, et al. Neuroblastoma. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16078.

3. Nakagawara A, Li Y, Izumi H, Muramori K, Inada H, Nishi M. Neuroblastoma. Jpn J Clin Oncol. 2018;48:214-241.

4. Brodeur GM, Pritchard J, Berthold F, et al. Revisions of the interna- tional criteria for neuroblastoma diagnosis, staging, and response to treatment. J Clin Oncol. 1993;11:1466-1477.

5. Cohn SL, Pearson ADJ, London WB, et al. The International Neuroblastoma Risk Group (INRG) classification system: an INRG Task Force report. J Clin Oncol. 2009;27:289-297.

6. Brodeur GM. Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma. Nat Rev Cancer. 2003;3:203-216.

7. Boon K, Caron HN, van Asperen R, et al. N-myc enhances the ex- pression of a large set of genes functioning in ribosome biogenesis and protein synthesis. EMBO J. 2001;20:1383-1393.

8. Valentijn LJ, Koster J, Haneveld F, et al. Functional MYCN signature predicts outcome of neuroblastoma irrespective of MYCN amplifi- cation. Proc Natl Acad Sci USA. 2012;109:19190-19195.

9. Wilson PM, Danenberg PV, Johnston PG, Lenz H-J, Ladner RD. Standing the test of time: targeting thymidylate biosynthesis in cancer therapy. Nat Rev Clin Oncol. 2014;11:282-298.

10. Mathews CK. Deoxyribonucleotide metabolism, mutagenesis and cancer. Nat Rev Cancer. 2015;15:528-539.

11. Lau DT, Flemming CL, Gherardi S, et al. MYCN amplification confers enhanced folate dependence and methotrexate sensitivity in neu- roblastoma. Oncotarget. 2015;6:15510-15523.

12. Peng M, Litman R, Xie J, Sharma S, Brosh RM, Cantor SB. The FANCJ/MutLalpha interaction is required for correction of the cross-link response in FA-J cells. EMBO J. 2007;26:3238-3249.

13. Santiago Y, Chan E, Liu P-Q, et al. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. PNAS. 2008;105:5809-5814.

14. Liu P-Q, Chan EM, Cost GJ, et al. Generation of a triple-gene knock- out mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases. Biotechnol Bioeng. 2010;106:97-105.

15. Zhang Q, Shen J, Wang H, et al. TS mRNA levels can predict peme- trexed and raltitrexed sensitivity in colorectal cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 2014;73:325-333.

16. Bartek J, Lukas J. Chk1 and Chk2 kinases in checkpoint control and cancer. Cancer Cell. 2003;3:421-429.

17. Byrne BM, Oakley GG. Replication protein A, the laxative that keeps DNA regular: the importance of RPA phosphorylation in maintaining genome stability. Semin Cell Dev Biol. 2019;86:112-120.

18. Dominguez-Sola D, Gautier J. MYC and the control of DNA replica- tion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2014;4:a014423.

19. Petroni M, Sardina F, Infante P, et al. MRE11 inhibition highlights a replication stress-dependent vulnerability of MYCN-driven tumors. Cell Death Dis. 2018;9:895-912.

20. Colicchia V, Petroni M, Guarguaglini G, et al. PARP inhibitors en- hance replication stress and cause mitotic catastrophe in MYCN- dependent neuroblastoma. Oncogene. 2017;36:4682-4691.

21. Saito K, Nagashima H, Noguchi K, et al. First-in-human, phase I dose-escalation study of single and multiple doses of a first- in-class enhancer of fluoropyrimidines, a dUTPase inhibitor (TAS-114) in healthy male volunteers. Cancer Chemother Pharmacol. 2014;73:577-583.

22. Hu C-M, Yeh M-T, Tsao N, et al. Tumor cells require thymidylate kinase to prevent dUTP incorporation during DNA repair. Cancer Cell. 2012;22:36-50.

23. Liu Y, Marks K, Cowley GS, et al. Metabolic and functional genomic studies identify deoxythymidylate kinase as a target in LKB1- mutant lung cancer. Cancer Discov. 2013;3:870-879.

24. Shih C, Chen VJ, Gossett LS, et al. LY231514, a pyrrolo[2,3-d]py- rimidine-based antifolate that inhibits multiple folate-requiring en- zymes. Cancer Res. 1997;57:1116-1123.

25. Shih C, Habeck LL, Mendelsohn LG, Chen VJ, Schultz RM. Multiple folate enzyme inhibition: mechanism of a novel pyrrolopyrimidine-based antifolate LY231514 (MTA). Adv Enzyme Regul. 1998;38:135-152.

26. Adjei AA. Pemetrexed (Alimta): a novel multitargeted antifolate agent. Expert Rev Anticancer Ther. 2003;3:145-156.

27. Bernstock JD, Alva E, Cohen JL, et al. Treatment of pediatric high- grade central nervous system tumors with high-dose methotrexate in combination with multiagent chemotherapy: a single-institution experience. Pediatr Blood Cancer. 2019;18:e28119.

28. Huang Z, Tong H-F, Li Y, et al. Effect of the polymorphism of folyl- polyglutamate synthetase on treatment of high-dose methotrex- ate in pediatric patients with acute lymphocytic leukemia. Med Sci Monit. 2016;22:4967-4973.

29. Walling J. From methotrexate to pemetrexed and beyond. A re- view of the pharmacodynamic and clinical properties of antifolates. Invest New Drugs. 2006;24:37-77.

30. Triarico S, Maurizi P, Mastrangelo S, Attinà G, Capozza MA, Ruggiero A. Improving the brain delivery of chemotherapeutic drugs in child- hood brain tumors. Cancers (Basel). 2019;11:824.

31. Matthay KK, Brisse H, Couanet D, et al. Central nervous system metastases in neuroblastoma: radiologic, clinical, and biologic fea- tures in 23 patients. Cancer. 2003;98:155-165.

32. Jackman AL, Boyle FT, Harrap KR. Tomudex (ZD1694): from con- cept to care, a programme in rational drug discovery. Invest New Drugs. 1996;14:305-316.

33. Kabeshima Y, Kubota T, Watanabe M, et al. A potential important role for thymidylate synthetase inhibition on antitumor activity of fluo- ropyrimidine and raltitexed. Anticancer Res. 2002;22:3245-3252.

34. Qiu C, Li Y, Liang X, et al. A study of peritoneal metastatic xenograft model of colorectal cancer in the treatment of hyperthermic intra- peritoneal chemotherapy with Raltitrexed. Biomed Pharmacother. 2017;92:149-156.

35. van Triest B, Pinedo HM, van Hensbergen Y, et al. Thymidylate synthase level as the main predictive parameter for sensitivity to 5-fluorouracil, but not for folate-based thymidylate synthase in- hibitors, in 13 nonselected colon cancer cell lines. Clin Cancer Res. 1999;5:643-654.

36. Zarzosa P, Navarro N, Giralt I, et al. Patient-derived xenografts for childhood solid tumors: a valuable tool to test new drugs and per- sonalize treatments. Clin Transl Oncol. 2017;19:44-50.

37. Tentler JJ, Tan AC, Weekes CD, et al. Patient-derived tumour xe- nografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 2012;9:338-350.

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