Upregulated Ribosomal Pathway Impairs Follicle Development in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse Model: Differential Gene Expression Analysis of Oocytes

概要

主論文の要旨

Upregulated Ribosomal Pathway Impairs Follicle
Development in a Polycystic Ovary Syndrome Mouse
Model: Differential Gene Expression Analysis of Oocytes
卵子における網羅的遺伝子解析：
多嚢胞性卵巣症候群モデルマウスにおけるリボソーム経路の
アップレギュレーションは卵胞の発育を阻害する

名古屋大学大学院医学系研究科
発育・加齢医学講座

産婦人科学分野

（指導：梶山 広明
仲西

総合医学専攻

菜月

教授）

【緒言】
多嚢胞性卵巣症候群(Polycystic Ovary Syndrome: PCOS)は、月経不順、高アンドロゲ
ン血症、多嚢胞性卵巣などを呈する内分泌疾患である。PCOS は性成熟期の女性の 813%で認められ、卵子の発育障害を伴い、不妊症の原因となる。また PCOS は心血管
性病変や糖尿病と関連があることが知られており、その病態より全身性の疾患と考え
られている。今までに、血液、骨格筋、脂肪細胞、卵巣全体や顆粒膜細胞、莢膜細胞
での遺伝子解析が行われ、いくつかの関連遺伝子が指摘されており、これらの遺伝子
が内分泌疾患、インスリン抵抗性や高アンドロゲン症状、排卵障害との関連している
ことが示唆されている。また、PCOS の病態として、視床下部-下垂体-卵巣軸における
内分泌ホルモンの異常が考えられているが、PCOS の発症機序は完全には解明されて
いない。本研究では、ヒトでは解析が困難である卵子に対する PCOS の影響を解析す
るため、PCOS モデルマウスの卵子を用いて、発現変動遺伝子(Differentially Expressed
Genes: DEGs)および DNA メチル化によるエピジェネティック変化を解析し、病因を
特定することを目的とした。
【対象及び方法】
PCOS は子宮内の高アンドロゲン環境が胎児に影響を与え、生殖年齢で PCOS を引
き起こすと考えられており、今回、妊娠 16～18 日目の C57BL/6J マウスに、250μg/日
の 5α ジヒドロテストステロンを皮下投与し、その子を PCOS モデルマウスとして作
成した(Fig.1a)。マウスの表現型は体重、性周期、卵巣組織形態によって評価した。79 週齢のマウスから採卵し、対象群、PCOS 群それぞれ 3 群ずつ RNA シークエンスに
よる卵子の遺伝子発現解析および Post‐Bisulfite Adaptor Tagging 法による DNA メチル
化解析を行なった。変動遺伝子の解析には DAVID Bioinformatics Resources 6.8 もしく
は the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes を用いて解析した。さらにマウスの卵
巣組織を用いて Rps21 もしくは Rpl36 タンパクの卵子における免疫組織化学染色を行
なった。
【結果】
PCOS モデルマウス群は対象群と比べ、体重変化には差はなく(Fig.1b)、発情周期の
異常(Fig.1c)と多嚢胞様の卵巣形態と黄体の増加(Fig.1d)を認め、既報と同様にヒトの
PCOS と類似していることが確認できた。PCOS モデルマウス群の卵巣では、small antral
follicle において形態学的に不健全な卵子の割合(対象群 vs PCOS モデルマウス群、
26.3%±8.4% vs. 44.2%±16.0%, P < 0.05)が増加した(Fig.1e)。さらに RNA シークエンス
による変動遺伝子解析の結果、PCOS モデルマウス群では対照群と比較し、90 個の
DEGs が発現上昇し、27 個の DEGs が発現低下した(Fig.2a)。遺伝子のオントロジー解
析では発現上昇群では免疫に関わるものが、発現低下群では胚着床に関わるものが抽
出された(Fig.2b,c)。パスウェイ解析の結果、PCOS マウスの卵子で 5 つの DEGs(Rps21,
Rpl36, Rpl36a, Rpl37a, Rpl22l1)が、リボソーム関連経路で上昇していた(Table 1)。DNA

-1-

メチル化解析の結果では、PCOS モデルマウス群で 30 カ所の低メチル化領域、10 カ所
の高メチル化領域を認めたが、DNA のメチル化変化は、発現変動遺伝子とは相関を認
めなかった。免疫組織化学染色では卵胞の発育段階によって卵子の染色強度が異なり、
発育段階の初期の卵胞ほど、Rps21 と Rpl36 の染色強度が有意に上昇していることが
明らかになった(Fig.3a,b)。遺伝子発現を Quantitative Reverse Transcription-Polymerase
Chain Reaction(qRT-PCR)法で検証し、Rps21、Rpl36 どちらも PCOS モデルマウス群で
発現量が上昇していた(Fig.3d,e)。また、卵巣全体で Rps21、Rpl36 タンパクの卵子の
染色強度を検証し、両タンパクとも染色強度は有意に上昇していた(Fig.3f,g)。卵胞を
4 つの発育段階に分け、染色強度の違いを検証し、PCOS モデルマウスの small antral
follicle の段階で有意に上昇していた(Table 2)。また、DNA メチル化解析では低メチル
化領域が 30 領域、高メチル化領域が 10 領域検出されたが、今回、DNA メチル化変異
領域と発現変動遺伝子の結果からは、メチル化変異領域と近位の転写開始点を持つ遺
伝子で、発現変動した遺伝子は認められなかった。
【考察】
本研究では、PCOS モデルマウスを作製し、卵子を用いた遺伝子解析を行なった。
PCOS モデルマウスについては、肥満がなく、月経周期の異常と多嚢胞卵胞の所見が
認められ、特にアジア圏で認められる PCOS の特徴を模倣しているモデルと考えられ
た。PCOS は排卵障害、卵子の質の低下のため、臨床において不妊となることが問題
となる。排卵障害は卵胞発育が正常に進行せず、小卵胞の段階で発育停止してしまい
成熟卵胞とならないことが原因と考えられる。卵胞発育は FSH 非依存性もしくは依存
性に発育する段階に分けられ、FSH 非依存性発育の段階の前胞状卵胞から AMH やア
ンドロゲンが分泌される。AMH の上昇は FSH の作用を抑制し、FSH によってアンド
ロゲンからエストロゲンへの置換が起こるが、PCOS では前胞状卵胞が増えることで
AMH やアンドロゲンが異常に上昇し、FSH が抑制されることでエストロゲンへの置
換が起きず高アンドロゲン状態となる。今回 small antral follicle(ヒトの前胞状卵胞に
相当)の段階で、Rps21 と Rpl36 蛋白の上昇がみとめられた。これらリボソーム関連遺
伝子の発現上昇により、小卵胞の数が増えることで、過剰な AMH が産生され、FSH
感受性をもつ卵胞において FSH に対する感受性が低下し、卵胞成熟を阻害すると考え
られた。
また発現変動遺伝子解析では胚着床やタイトジャンクションの機能低下が、卵胞に
おける卵子-顆粒膜細胞の相互作用を阻害することで PCOS における卵子の質が低下
し、流産の増加につながる可能性が示唆された。
【結語】
PCOS モデルマウスを作製することで、ヒトでは多数の検体での解析が困難である
卵子の解析を行なった。PCOS に特徴的な前胞状卵胞での発育停止に、今回遺伝子解
析で抽出されたリボソーム遺伝子群が関連している可能性が示唆され、病態解明の一
助となると考えられた。

-2-

Table 1. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis of
differentially expressed genes.
KEGG term name

Genes

P-value

Pathways in which upregulated genes in PCOS group are enriched
mmu03010: Ribosome
Rps21, Rpl36, Rpl36a, Rpl37a, and Rpl22l1
Pathways in which downregulated genes in PCOS group are enriched
mmu04530: Tight junction
Myh15, 4930544G11Rik, Myh7, and Cldn10

0.0049
0.0284

Table 2. Rps21 and Rpl36 staining intensities in preantral, small antral, large antral, and preovulatory
follicles.
Rps21
Follicle type
Preantral follicle
Small antral follicle *
Large antral follicle
Preovulatory follicle

Control
PCOS
Control
PCOS
Control
PCOS
Control
PCOS

Rpl36
Follicle type
Control
PCOS

Small antral follicle *

Control

Preovulatory follicle

42 (16.2%)
24 (10.0%)

PCOS
Control
PCOS
Control
PCOS

(3+)
159 (61.2%)
145 (60.7%)
21 (8.1%)
36 (15.1%)

33 (12.7%)
32 (13.4%)
5 (1.8%)
2 (0.8%)
Staining intensity
(2+)

(1+)

Preantral follicle

Large antral follicle

Staining intensity
(2+)

(1+)

(3+) %
87 (62.6%)
70 (59.3%)

14 (10.1%)
3 (2.5%)
17 (12.2%)
10 (8.5%)
1 (0.7%)
2 (1.7%)

Note: Values represent oocyte number (%) at each follicle stage.
*P<0.01. The Mann-Whitney U-test

-3-

3 (2.5%)
1 (0.8%)

20 (14.4%)
29 (24.6%)

Fig. 1
a

b

c

control

DHT

Vehicle / DHT s.c.,to pregnant
dams at 16-18th gestational day

oocyte collection
Check vaginal smear
and body weight

0

body weight (g)

20-

15-

10-

5-

16 17 18

control (n=7)
DHT (n=7)

gestational days
0

21

56

21

d

28

35
42
days of age

49

e
% of unhealthy oocyte
in each stage of follicles

70

CL
CL

CL

CL

*

60
50
40
30
20
10
0
preantral

control

DHT

small antral

Control

large antral

DHT

Fig.1 Assessment of bodyweight, estrous cycle, and ovarian morphology in polycystic ovary syndrome (PCOS) mouse
model. a Schematic illustration of oocyte retrieval. s.c., subcutaneously. b Evaluation of bodyweight. Data are presented
as the mean ± standard error of the mean. c Representative estrous cycles. E, estrus; P, proestrus; and D, diestrus. The
PCOS mouse model mostly exhibited irregular estrus cycles. d Morphology of the ovaries. Bars, 200 μm. CL, corpora
lutea. e Percentage of unhealthy oocytes in each follicle stage. Data are presented as the mean ± SD (n = 10). *P < 0.05

-4-

Fig. 2
a
-log (P-value)

8
6

28 genes

90 genes

4
2
0
-4

-2
0
log (fold change)

2

b
■Fold Enrichment

c

30

22.5

15

7.5

gene ontology

genes

GO:0030889
GO:0030889~negative
negative regulation
regulation
of B cell proliferation
of B…

Rps21, Rpl36, Rpl36a, Rpl37a, Rpl22l1

GO:0001649
GO:0001649~osteoblast
osteoblast differentiation
differentiation

Btla, Ctla4

GO:0002250
GO:0002250~adaptive
adaptive immune response
immune response

Sfrp1, Gja1, Igfbp5

GO:0006412
GO:0006412~translation
translation

Btla, Ctla4, Themis

0
GO:0045664~regulation
ofdifferentiation
neuron differentiationFlt3, Pax6, Hspa1a, Timp2
GO:0045664
regulation of neuron
GO:0007566~embryo
implantation
GO:0007566
embryo implantation

Pax6, Timp2

GO:0045665~negative
regulation
neuron differentiation
GO:0045665
negative regulation
of neuron of
differentiation
M1ap, Flt3, Pax6, Tcf4
GO:0030216~keratinocyte
differentiation
GO:0030216
keratinocyte differentiation

Stc2, Zscan4b

GO:0008285~negative
regulation
of cell proliferation
GO:0008285
negative regulation
of cell proliferation
Rap1gap, Pax6
GO:0030154~cell
differentiation
GO:0030154
cell differentiation
60

45

30

15

Pou2f3, Pax6

0

q

Fig. 2 Differentially expressed genes in oocytes from a polycystic ovary syndrome (PCOS) mouse model.
(a) Volcano plot with default log (fold-change) thresholds of −1 and 1 and an adjusted p-value threshold of 0.05. The
expression of 90 genes was upregulated (> log (fold-change) thresholds of 1), whereas the expression of 28 genes was
downregulated (< log (fold-change) thresholds of −1). (b,c) Results of gene ontology (GO) analysis performed using
DAVID Bioinformatics Resources 6.8. GO terms in which the upregulated (b) and downregulated (c) genes are enriched.

-5-

Fig. 3 Immunostaining of Rps21 and Rpl36 in the ovary.
(a) Rps21 and (b) Rpl36 immunohistochemical staining intensities in the oocytes of the preantral, small antral, and
large follicles from control and PCOS groups. Bars, 200 µm. (c) Negative control for immunostaining. Relative mRNA
expression levels of (d) Rps21 and (e) Rpl36 were quantified by qRT-PCR. Expression levels are shown relative to
β-actin expression. Data are shown as the mean ± SEM of assays conducted in duplicate obtained from four ovaries
from the control and PCOS groups. Histology scores of (f) Rps21 (n = 260 oocytes for the control group; n = 239
oocytes for the PCOS group) and (g) Rpl36 (n = 137 oocytes for the control group; n = 118 oocytes for the PCOS
group) immunohistochemical staining intensities in different follicles of the ovary. Data are represented as the mean ±
standard error of the mean. *P < 0.05 using the Mann-Whitney U-test.

-6-