論文の公開元へThe function of Spt3, a subunit of the SAGA complex, in PGK1 transcription is restored only partially when reintroduced by plasmid into taf1 spt3 double mutant yeast strains
概要
真核生物におけるクラス II 遺伝子の転写は、コアプロモーター領域に基本転写因子群(TFIIA, B, D, E, F, H)、ならびにメディエーターと RNA ポリメラーゼ II (Pol II)が集合し、転写開始前複合体 (PIC)を形成後に特定の部位から開始することが知られている。出芽酵母の場合、TATA ボックスと TATA 様配列 (TATA ボックスと比較し、1 or 2 bp のミスマッチを有する) のいずれかを含む 2 種類のコアプロモーターが存在する。基本転写因子 TFIID は、TBP (TATA-binding protein)と 14 種類の Tafs (TBP-associated factors)から構成される巨大なタンパク質複合体であり、PIC 形成初期に TATA ボックスもしくはTATA 様配列に結合し、その他の基本転写因子群と Pol II をコアプロモーター上にリクルートする役割を有する。TFIID サブユニットの一つである Taf1 の N 末端ドメイン(TAND)は、TBP の TATA ボックスもしくは TATA 様配列への結合において重要な役割を果たすと考えられているが、その詳細な仕組みについては未だ明らかにされていない。TFIID の類縁複合体である SAGA (Spt-Ada-Gnc5-acetyltransferase)は 19 種類のサブユニットから構成され、5 種類のサブユニット（TAF モジュールの構成成分）を TFIID と共有し、Spt3, Spt8 等から成る TBP モジュールの働きにより、TFIID と同様、TBP の活性制御を行うとされている。従来、SAGA はストレス誘導性遺伝子プロモーター（TATAボックス含有型であることが多い）からの転写を、TFIID はハウスキーピング遺伝子プロモーター（TATA 様配列含有型であることが多い）からの転写を制御すると考えられてきたが(1)、近年、両者はほぼ全てのクラス II 遺伝子の転写に関与することが明らかとなった(2, 3, 4)。実際、当研究室においても、SAGA が TATA 様配列含有型プロモーターからの転写を媒介できることが示されている(5)。一方、いくつかの TATA 様配列含有型プロモーターにおいて、TATA ボックスの挿入が TFIID 依存性の消失もしくは低下に繋がるとの報告があることから、TFIID を介した転写の仕組みは TATA ボックスの有無により異なると考えられている(6, 7, 8)。しかしながら、SAGA が TATA ボックスの有無に応じて異なる仕組みで転写するのかについてはまだよく分かっていない。本研究では PGK1 プロモーターをモデルとし、TFIID と同様、SAGA は TATA ボックス含有型プロモーターからの転写と TATA 様配列含有型プロモーターからの転写を異なるメカニズムで媒介することを示した。また SAGA サブユニットの一つである Spt3 には、少なくとも二種類の機能（TATA ボックスに依存して転写を促進する機能と PGK1 プロモーターに対して TFIID非依存性を付与する機能）が存在することを示した。
実験方法
ノザンブロットによる内在性 PGK1 mRNA とレポーター遺伝子である VTC1 mRNA の検出
本研究では 25ºC から 37ºC へ温度シフト後に TFIID 変異が PGK1 転写に与える影響を詳しく調べた。TFIID サブユニットの一つをコードする TAF1 は必須遺伝子であるため、温度感受性変異体である taf1-ΔTAND または taf1-N568Δを有する株を使用した。またPGK1 プロモーター中の TATA ボックスの重要性については VTC1 レポーターシステムを用いて解析を行った (図 1)。合成液体培地 (SC 培地)中において前培養後 (25ºC)、37ºC にシフトし、15, 30, 45, 60, 90, 120 分後に酵母細胞を回収した。回収した酵母細胞からtotal RNA (10-20 ug)を抽出後、ホルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動を行い、ナイロンメンブレンにトランスファーした。ランダムプライミング法により 32P 標識したDNA プローブを含むハイブリダイゼーションバッファーにナイロンメンブレンを浸し、終夜インキュベートした。メンブレンは洗浄後、イメージングプレート(富士フィルム)に適当な時間露光し、Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare)によりバンドの検出を行った。バンドの定量は ImageQuant TL software version 8.1 (GE Healthcare)を用いて行った。
プライマー伸長法
プライマー伸長法を用いて、野生型 TATA ボックスもしくは変異型 TATA ボックス（TATA 様配列）含有型 PGK1 プロモーターの転写開始点を決定した。32P 標識したプライマーを用いて VTC1 mRNA を cDNA に逆転写し、逆転写産物を 6%尿素変性ポリアクリルアミドシーケンスゲルにより分離した。ゲルを乾燥後、イメージングプレート(富士フィルム)に適当な時間露光し、Typhoon FLA 7000 (GE Healthcare)によりバンドの検出を行った。バンドの定量は ImageQuant TL software version 8.1 (GE Healthcare)を用いて行った。
研究結果
PGK1 転写の TFIID 依存性は SPT3 遺伝子の由来（染色体上 or プラスミド上）に依存する
PGK1 転写は、TFIID ではなく SAGA に依存することが知られている。一方、ChIP 解析の結果は、①TFIID が PGK1 プロモーターに結合すること、②ヒートショック後にその結合レベルが上昇することを示しており、TFIID が PGK1 転写に関与する可能性も十分に考えられる。そこで申請者は、TFIID 変異株において、ヒートショック後の PGK1 転写の消長（キネティクス）を詳しく調べることにより、PGK1 転写における TFIID の関与の有無を明らかにできるのではないかと考えた。そこで、TFIID サブユニットの Taf1 と SAGAサブユニットの Spt3 を解析対象とし、各々の単独変異株ならびに二重変異株を作製することとした。具体的には、TAF1 欠失変異（taf1D）株に、野生型 TAF1 アレル、温度感受性変異型 taf1-ΔTAND アレル、もしくは温度感受性変異型 taf1-N568Δアレルのいずれかを有するプラスミドを導入した一連の酵母株に対して、SPT3 欠失変異（spt3D）を導入し、さらに SPT3 発現プラスミドを形質転換することにより SPT3 株を作製した（註; 本研究では spt3D変異導入前の SPT3 株と、当該変異導入後に SPT3 発現プラスミドの形質転換により作製した SPT3 株の二種類を使用していることに注意）。spt3D変異導入前のSPT3 株と当該変異導入後の spt3D株（図 2A, C）、もしくは spt3D株に SPT3 発現プラスミドまたは empty vector を形質転換した SPT3 株と spt3D株（図 2B, D）について、ヒートショック（培地を 25ºC から 37ºC へシフト）後の PGK1 転写の詳細なキネティクスを調べた（図 2）。
その結果、過去の知見と一致し、内在性の PGK1 転写は、spt3Δ変異により約半分に低下したが(図 2A, C [b, d])、taf1 変異の影響はほとんど受けないことが明らかとなった（図2A, C [e, g, i, k]; 37ºC シフト 2h 後に注目）。しかしながら、キネティクスを詳しく調べたところ、37ºC にシフト後において、taf1-ΔTAND 株(図 2A, C [e, g])及び taf1-N568Δ株(図 2A, C [i, k])については、PGK1 mRNA の一過的な減少と上昇がそれぞれ観察された。また taf1 変異と spt3Δ変異の両方を有する二重変異株では、いずれの場合も PGK1 転写
の有意な低下が観察された(図 2A, C [f, h, j, l])。
次に VTC1 レポーターシステムを用いて、PGK1 プロモーター中の TATA ボックスをGAGA 配列に置換した際の転写（以下、PGK1[GAGA]転写と表記）のキネティクスを調べたところ、spt3Δ変異株の場合(図 2A, C [n])と同様、約半分に低下することが明らかとなったが(図 2A, C [o])、そこに spt3Δ変異を組み合わせてもさらなる低下は見られず(図2A, C [p])、両 taf1 変異による影響も観察されなかった(図 2A, C [s, w])。以上の結果は、①Spt3 は TATA ボックス依存的に PGK1 転写を活性化すること、及び②TATA ボックス
を GAGA 配列に変えても TFIID 依存性は付与されないことを示している。一方、taf1-ΔTAND 株において、GAGA 変異は温度シフト後の一過的な変動（Spt3 依存的な mRNAレベルの低下とその後の回復）に影響を与えなかったが（図 2A, C [q, s]）、spt3Δ taf1-ΔTAND 二重変異株の場合は、PGK1[GAGA]転写の有意な低下が観察された（図 2A, C[r, t]）。これらの結果は、Spt3 欠損時において、TAND が TATA ボックス依存的に PGK1転写を促進する機能を有することを示唆している。
spt3Δ株に SPT3 発現プラスミドまたは empty vector を形質転換した SPT3 株と spt3Δ株を比較したところ、上記の taf1-ΔTAND 株において観察された温度シフト後の一過的な変動はほぼ消失し（図 2B, D [e, g, q, s]; q においてのみ弱い変動が残存）、taf1-N568Δ変異による PGK1[GAGA]転写の有意な低下が新たに観察されたことから（図 2B, D[w]）、プラスミド上の遺伝子に由来する Spt3（以下 Spt3[plasmid]と表記）の機能と染色体上の遺伝子に由来する Spt3（以下 Spt3[genome]と表記）の機能は互いに異なることが明らかとなった。一方、Spt3[genome]と同様、Spt3[plasmid]についても、TATA ボックス依存的な PGK1 転写の促進活性が見られたことから（図 2B, D [a, b, m, n]）、Spt3 は、少なくとも二種類の機能（Spt3[genome], Spt3[plasmid]に共通して見られる①TATA ボックス依存的な転写促進活性、及び Spt3[genome]のみに見られる②PGK1 プロモーター対して TFIID 非依存性を付与する機能）を有すると考えられる。
PGK1 プロモーターの転写開始部位は Spt3[plasmid]の導入や GAGA 配列への置換により変化しない
Spt3[plasmid]の導入や GAGA 配列への置換が PGK1 プロモーターの転写開始部位 (TSS)に影響を及ぼすかについて調べるため、プライマー伸長実験を行った。その結果、図 2 において見られた転写強度の変化は、各 TSS バンドの強度変化として現れたが、TSS プロファイル（各 TSS バンド間の強度比の変化、新たなバンドの出現や既存バンドの消失等）自体に変化は見られないことが明らかとなった（図 3A, B）。すなわち、図 2 において観察された複数の変化（spt3Δ変異の導入や GAGA 配列への置換により生じた mRNA レベルの低下、Spt3[genome]と Spt3[plasmid]の機能の違い等）は 全て TSS の変化を介さずに起こることが示された。従って、Spt3[plasmid]を有する株においてのみ見られた PGK1[GAGA]転写の TFIID 依存性は、TFIID による TSS 決定機構の異常によるものではないと考えられる。
PGK1 コアプロモーター中の CATAAATT 配列及び TACATATT 配列はコアプロモーター配列（2 bp のミスマッチを有する TATA 様配列）として機能する
VTC1 レポーター実験において、GAGA 配列への置換は PGK1 転写レベルを約半分に低下させたが（図 2A, D 及び図 3A, B）、依然として残り半分の転写は影響を受けないことから、PGK1 コアプロモーター中には、TATA ボックス以外のコアプロモーター配列（CPE）が存在する可能性が高いと考えられる。そこで、PGK1 コアプロモーター中に存在する二種類の TATA 様配列（いずれも 2 bp のミスマッチを有する）、CATAAATT 配列（図 4A, #2）及び TACATATT 配列（図 4A, #3）が CPE として機能できるかを調べた。その結果、いずれの TATA 様配列も、TATA ボックスの存在下では CPE として機能するようには見えなかったが（図 4C, レーン 1 [WT], 3-5 [mut 2-4]）、TATA ボックス非存在下（図 4C, レーン 2 [mut 1]）では、CATAAATTT 配列のみが CPE として機能し（図4C, レーン 2 [mut 1], 6 [mut 5], 7 [mut 6]を比較）、TATA ボックス及び CATAAATTT 配列非存在下（図 4C, レーン 7 [mut 6]）では、TACATATT 配列も CPE として機能する（図 4C, レーン 7 [mut 6], 8 [mut 7]を比較）ことが明らかとなった。以上の結果は、①PGK1 プロモーター中には３種類の CPE が存在すること、及び②これらの CPE 間には機能的な極性がある（各 CPE が機能するためには、最も上流側に位置する必要がある）ことを示唆している。
PGK1 転写の TFIID 依存性は CPE の組み合わせを変更しても付与できない
spt3Δ taf1-N568Δ株に SPT3 発現プラスミドを導入した SPT3 taf1-N568Δ株では、PGK1[GAGA]転写が TFIID 依存性を示したことから(図 2B, D [w])、PGK1 プロモーターには TFIID 依存的に転写されるポテンシャルがあると考えられる。そこで、Spt3[genome]の存在下、CPE の組み合わせを様々に変更することにより、PGK1 転写における TFIID 依存性の有無の変化を調べた。その結果、いずれの場合も PGK1 転写はTFIID 非依存性を示したことから(図 5A, B [g, h, i])、少なくとも Spt3[genome]の存在下において、シス配列の変更により TFIID 依存性を新たに付与することはできないと考えられる。また Spt3[genome]による TATA ボックス依存的な転写促進活性は、CATAAATTT配列や TACATATT 配列の非存在下においても同等であったことから(図 5B, WT 及びmut2-4)、当該活性にこれらの配列は不要と考えられる。
考察
本研究において、Spt3[plasmid]は、PGK1[GAGA]転写の TFIID 非依存性を保持する活性を喪失する一方(図 2B, D [w])、Spt3[genome]と同様、TATA ボックスに依存して転写を促進する活性については taf1-N568D変異の存在下においても保持していること(図 2B, D[m-p, u-x])が明らかとなった。すなわち、Spt3 には二種類の機能が存在し、TATA ボックスに依存して転写を促進する活性は、PGK1[GAGA]転写が TFIID 依存性を示すようになった Spt3[plasmid]においても保持されていたことから、TFIID とは独立に発現する活性であると考えられる。またこのことは、TATA 様配列含有型プロモーターからの転写（PGK1[GAGA]転写）と TATA ボックス含有型プロモーターからの転写（野生型 PGK1転写）において必要な Spt3 の機能が異なること（註；Spt3[plasmid]は前者の活性のみを
欠損している）、すなわち TFIID のみならず SAGA も TATA ボックスの有無に応じて異なるメカニズムにより転写を媒介していることを明確に示している。
PGK1 プロモーター中に存在する複数の CPE の組み合わせを変更しても PGK1 プロモーターに TFIID 依存性を付与することはできなかった（図 5）。当研究室の以前の研究において、転写の活性化は、①上流活性化配列 (UAS)に結合した転写調節因子がコア因子（TFIID または SAGA のいずれか）を指定する、②指定されたコア因子がコアプロモーター配列に応じて適切な様式で転写を媒介する、という二段階を経て起こるというモデルが提唱されている（5）。このモデルが正しければ、UAS に変異を導入しない限り、TFIID依存性は変化しないと考えられることから、今回の結果を合理的に説明することができる。ただし UAS に変異を導入することなく、Spt3[plasmid]は PGK1[GAGA]転写のTFIID 非依存性を喪失したことから、当該 Spt3 を含む SAGA は転写調節因子との相互作
用に異常をきたし、その結果として異なるコア因子（SAGA ではなく TFIID）が指定され、PGK1 コアプロモーターが TFIID にも適応可能な CPE を有していたために今回の現象が観察されたのではないかと考えている。
結論
① Spt3 には二種類の活性が存在する
② Spt3[plasmid]は PGK1[GAGA]転写の TFIID 非依存性を保持する活性を失っている
③ Spt3[plasmid]による PGK1[GAGA]転写の TFIID 依存性は、TFIID の TSS 決定能の変化によるものではない
④ PGK1 プロモーター中の CATAAATT 配列は TATA 様配列として機能する
⑤ Spt3[genome]存在下ではシス配列の組み合わせを変更しても PGK1 プロモーターにTFIID 依存性を付与することはできない
⑥ TFIID だけではなく、SAGA も TATA ボックスの有無により、異なるメカニズムで転写を媒介する能力を有する
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