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Streptococcus pneumoniae hijacks host autophagy by deploying CbpC as a decoy for Atg14 depletion

雫石 早矢佳 横浜市立大学

2022.03.25

概要

1. 序論
肺炎球菌はグラム陽性双球菌であり,肺炎の原因菌であることに加えて敗血症や髄膜炎など重篤な侵襲性肺炎球菌感染症を引き起こす(van der Poll and Opal, 2009).肺炎球菌の侵入門戸は鼻咽頭上皮細胞であり,エンドサイトーシス経路で侵入した菌は,最終的に細胞内分解機構であるオートファジーによって認識・殺菌されることが報告されている(Ogawa et al., 2018, Ogawa et al., 2020).細胞侵入性細菌に対するオートファジーはゼノファジーと呼ばれているが,赤痢菌やリステリアはゼノファジーを抑制する病原因子をもつことが知られている(Ogawa et al., 2005)(Yoshikawa et al., 2009).しかし,細胞内に侵入した肺炎球菌がゼノファジーを抑制するかについては不明である.さらに,感染細胞内において肺炎球菌が保有する病原因子が機能を発揮する可能性については報告がない.そこで本研究では,細胞内に侵入した肺炎球菌がゼノファジーを抑制する可能性を検討するため,菌体表層に局在する病原因子であるコリン結合性タンパク質ファミリー(Cbpファミリー)に着目し,解析を行った.

2. 実験材料と方法
オートファジーに関与するCbpファミリーの探索は,GFPを融合させた10種類のCbpファミリーをHela細胞に一過性に発現させて行った.CbpCによるオートファジーへの影響は,293T細胞にGFP-CbpCを一過性に発現させ,ウェスタンブロッティング法でオートファジーマーカーであるLC-Ⅱ量を検出することにより解析した.CbpC誘導性オートファジーの感染に対する意義は,肺炎球菌野生株またはCbpC欠失変異株(ΔcbpC株)を,肺炎球菌が細胞に侵入するために必要な宿主側の受容体であるpIgR(polymeric immunoglobulin receptor)を安定発現させたMEF細胞に感染させ,感染0,1,2または3時間後の細胞内生残性を解析した.CbpCと結合するオートファジー関連因子については,コムギ無細胞系により合成したCbpCと宿主タンパク質を用いたプルダウンアッセイにて一次スクリーニングを行った後,得られた候補因子についてさらに免疫沈降実験にて二次スクリーニングを行った.感染細胞におけるAtg14の挙動については,タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド存在下で肺炎球菌野生株またはΔcbpC株を,HA-Atg14とpIgRを安定発現させたMEF細胞に1,2または3時間感染させ,ウェスタンブロッティング法で各タイムコースにおける細胞中のHA-Atg14量を検出することにより解析した.肺炎球菌感染細胞内におけるCbpC依存的なAtg14量の低下がオートファジー依存的な分解であることの検証は,オートファジー阻害剤であるバフィロマイシンA1存在下で同様に解析した.ゼノファジー不全条件下において,ΔcbpC株の細胞内生残菌数低下が野生株と同程度に回復することは,肺炎球菌野生株またはΔcbpC株を,pIgRを安定発現させたAtg5 KO MEF細胞に感染させ,細胞内生残性試験を行うことにより検証した.

3. 結果
10種類のCbpファミリーについてオートファジーへの関与を検討した結果,CbpCがオートファジー誘導能を持つことが明らかになった.そこでΔcbpC株の細胞内生残菌数を解析した結果,CbpCはオートファジー誘導性があるにも関わらず菌の生存を正に制御するという予想外の結果を得た.そこで感染におけるCbpC誘導性オートファジーの意義解明のため,CbpCと結合するオートファジー関連因子のスクリーニングを行った.その結果,Atg14がCbpCと特異的に結合したことから,肺炎球菌感染細胞におけるAtg14量を経時的に解析した結果,CbpC依存的にAtg14が分解されていた.さらに,その分解はオートファジー阻害剤で抑制されたことから,CbpC誘導性オートファジーがAtg14分解に関与することが明らかになった.Atg14はゼノファジー必須因子であるため,Atg14の分解および枯渇により,ゼノファジーが抑制されると予想した.実際に,ゼノファジー不全細胞では野生株とΔcbpC株との細胞内生残菌数の差が消失したことから,肺炎球菌はCbpCを用いてゼノファジーを抑制していることが明らかになった.次に,CbpC誘導性オートファジーは,Atg14を標的とした選択的オートファジーであることから,選択的オートファジーのアダプタータンパク質p62とAtg14-CbpC結合体との結合を解析した.その結果,p62はCbpCを介して結合してAtg14-CbpC-p62複合体を形成し,その形成依存的にAtg14が分解されていた.最後に,報告されている2種類のCbpCオーソログに関してホモロジーモデリングによる構造比較を行った結果,Atg14との結合およびオートファジー誘導能は認められず,Atg14に対する選択的なオートファジー誘導はCbpC特異的な機能であることが明らかになった.

4. 考察
本研究により,細胞内に侵入した肺炎球菌は宿主の殺菌機構から逃れるために,病原因子CbpCをおとりにしてAtg14を分解することによりゼノファジーを抑制していることが明らかになった.CbpCは病原因子LytCの有する自己溶菌活性を菌体外で抑制することが知られているが(Molina et al., 2009),本研究によりCbpCの菌体内での新たな機能が明らかになった.肺炎球菌感染細胞の細胞質において菌体から放出された病原因子が宿主因子と相互作用することにより病原性を発揮することを解明したのは本研究が初めての例であり,本研究によりCbpC以外のコリン結合性タンパク質についても感染細胞の細胞質で宿主因子と相互作用し,新たな機能を発揮する可能性が提起された.

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参考文献

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