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Investigation of compensatory autophagy and T cell senescence during proteasome dysfunction

荒田, 義之 東京大学 DOI:10.15083/0002005151

2022.06.22

概要

プロテアソームは細胞内タンパク質分解を介して様々な⽣命現象に関与している。そのため、プロテアソーム機能の低下は、⽣体に広範な異常を来し、近年では特に⽼化との関連が注⽬されている。したがって、プロテアソーム機能低下時に⽣体がどのように応答をし、細胞・個体⽼化に⾄るのかの理解は、⽼化あるいは加齢に伴い発症率の上昇する⾃⼰免疫疾患等の予防や治療にむけて重要になりうる。本研究ではプロテアソーム機能低下時に起こる⽣命現象について、1)プロテアソーム機能低下に応じて代償的に誘導されるオートファジー活性化機構2)T細胞⽼化に伴うプロテアソーム機能低下に着⽬して研究を⾏なった。

1. プロテアソーム機能低下時の代償的オートファジー誘導機構
 プロテアソームの形成シャペロンp28と結合する因⼦を質量分析法により網羅的に解析したところ、プロテアソーム阻害剤処置条件下においてFAM48Aが結合因⼦の1つとして同定された。FAM48Aは今までプロテアソームとの関連は報告されていなかったが、オートファジーを制御することが知られる因⼦であった。主要な細胞内タンパク質分解系であるユビキチン・プロテアソームシステムとオートファジーは協調して働き、プロテアソーム機能低下時にオートファジーが代償的に誘導され、細胞の機能維持にはたらくことが知られる。しかしながら、その詳細なメカニズムは不明であった。そこでFAM48Aが代償的オートファジーを制御する可能性を考え解析を⾏った。
 プロテアソーム機能低下時に誘導される代償的オートファジー誘導にFAM48Aが関与するか調べるためにFAM48Aのノックダウンを⾏なった。オートファジー誘導のマーカーであるLC3-IIの蓄積及びLC3のドット状構造の形成をそれぞれウエスタンブロット法及び免疫染⾊法で評価したところ、FAM48Aのノックダウンによりプロテアソームを阻害した細胞におけるオートファジー誘導が顕著に抑制された(図1a,b)。このことからFAM48Aはプロテアソーム機能低下時に誘導される代償的オートファジーを仲介することが⽰唆された。
 FAM48Aはオートファジーに必須の因⼦であるAtg9と結合することが知られる。Atg9はトランスゴルジ網あるいはエンドソームを介したメンブレントラフィックによって脂質供給を⾏い、オートファジー誘導働く。Atg9とそれぞれトランスゴルジ網マーカー及びリサイクリングエンドソームのマーカーであるGM130及びRab11との共局在を調べたところ、プロテアソーム阻害剤処置した細胞においてAtg9とGM130あるいはRab11の共局在はFAM48Aノックダウンにより顕著に減少した。このことからFAM48Aはプロテアソーム機能低下時にAtg9のメンブレントラフィックを制御することが⽰唆された。
 以上の結果から新規に同定したプロテアソーム結合因⼦FAM48Aがプロテアソーム機能低下時にAtg9のメンブレントラフィック制御を介してオートファジーを代償的に誘導する分⼦メカニズムの⼀端が⽰された。

2. T細胞⽼化に伴うプロテアソーム機能低下
 プロテアソーム機能は⽼化の過程及びCD4陽性T細胞依存的な免疫反応に深く関わることが知られている。しかしながら、CD4陽性T細胞の⽼化とプロテアソーム機能の関連は未知であった。
 まずプロテアソーム機能低下がCD4陽性T細胞において⽼化を引き起こす可能性について検討した。T細胞受容体(TCR)刺激したCD4陽性T細胞をプロテアソーム阻害剤処置したところ、p21発現上昇を伴った細胞増殖の低下及び細胞⽼化関連分泌形質(SASP)関連遺伝⼦の上昇がみられた。さらにプロテアソームの必須サブユニットの1つであるRpn13をT細胞特異的に⽋損したマウスではPD-1+CD44HighCD4陽性Tの増加が⾒られた。これらの特徴は⽼化CD4陽性T細胞が⽰す特徴と合致しており、プロテアソーム機能低下はCD4陽性T細胞においても⽼化様の症状を促進することが⽰唆された。
 ⼀部の細胞腫では⽼化に伴いプロテアソームの量が減少することが知られており、本研究においてはCD4陽性T細胞におけるプロテアソームの量的制御機構を調べた。TCR刺激したCD4陽性T細胞において、すべてのプロテアソームサブユニットの遺伝⼦発現及びプロテアソーム活性の上昇がみられたことから、TCR刺激依存的にプロテアソームを誘導する機構が認められた。また、阻害剤を⽤いた検討からこの発現誘導はTCRの下流のMEK、IKK、及びカルシニューリン依存的な経路を介することが⽰唆された。
 CD4陽性T細胞においてプロテアソーム機能が加齢に伴い減少しているか確認するためにプロテアソームサブユニットRpn11のC末端にGFPを付加したノックインレポーターマウスを⽤いて検討を⾏なった。脾臓から分取した細胞をフローサイトメトリーにより解析したところ定常状態ではCD4陽性T細胞中のRpn11-GFP量の加齢に応じた減少はみられなかった。⼀⽅でTCR刺激したCD4陽性T細胞を調べたところ、加齢依存的にプロテアソーム発現誘導が減弱した細胞集団の増加がみられた(図2)。各種CD4T細胞のサブポピュレーションごとのプロテアソーム誘導能を調べたところ、⽼齢マウスで増加することが知られるPD-1+CD44HighCD4陽性T細胞において顕著にプロテアソーム誘導が減弱していた。
 以上の結果からプロテアソームの発現誘導の減弱がCD4陽性T細胞⽼化の特性の1つであることが⽰された。

【まとめ】
 本研究において主要な細胞内タンパク質分解系であるプロテアソームとオートファジーを介在する新規因⼦としてFAM48Aを同定した。FAM48Aはプロテアソーム機能阻害時に細胞内に蓄積することからプロテアソーム機能低下を感知するセンサーとしての役割をもち、Atg9のメンブレントラフィックの制御を介して代償的オートファジー活性化に働くと考えられる。プロテアソーム機能低下時に蓄積したFAM48AがAtg9の局在を制御する詳細な機構は未知であり、今後解明すべき課題である。
 プロテアソームの発現量は細胞の種類や細胞の置かれる環境に応じて変化することが近年わかってきたが、その制御機構は未解明な部分が多い。本研究ではTCR刺激依存的にプロテアソーム発現量が増加すること、さらに加齢に伴いその発現誘導が減弱していくことが⽰され、T細胞に特有のプロテアソーム発現制御機構が明らかとなった。⽼化CD4陽性T細胞はSASP因⼦の分泌を介しマウスにおいて⾃⼰免疫疾患を引き起こすことが知られているが、本研究においてプロテアソーム機能低下はCD4陽性T細胞におけるSASP因⼦の発現亢進を引き起こすこと、及び⽼化CD4陽性T細胞においてTCR刺激に伴うプロテアソーム機能上昇が抑制されることが明らかになった。そのため⽼化CD4陽性T細胞におけるプロテアソーム誘導を抑制する機構は加齢性疾患の治療標的となることが期待される。

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