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Hydrostatic pressure suppresses fibrotic changes via Akt/GSK‐3 signaling in human cardiac fibroblasts

田中 遼 横浜市立大学

2020.03.25

概要

１．序論
本研究の目的は，心筋組織内で発生している力学的負荷と心臓線維芽細胞が制御する創傷治癒過程に着目して，予後不良となる心室リモデリングの予防法を提案することである.

本邦における心疾患は，2018年の死因別死亡数では全体の15.2%を占めており，悪性新生物に次ぐ2番目の主要な死因となっている．さらに心疾患による死亡数の半数以上が虚血性心疾患を背景とした心筋障害であり（厚生労働省. 2018），それに対する新たな治療法や病態の解明が重要である．心筋障害後に左室内腔の拡大を伴う症例では，予後不良の転機をたどる事が知られている（Gaudron et al., 2001）．これは心筋障害が広範囲に至る場合に加え，心筋障害後の不適切な創傷治癒や神経体液因子や機械的負荷により，有害な心室リモデリングが進行することに起因する．過度な神経体液因子を是正するβ遮断薬やアンジオテンシン変換酵素阻害薬が，明確なエビデンスをもつ治療法として現在広く用いられているが，機械的負荷や創傷治癒を標的とした治療法は確立されていない．

心筋障害後に適切に創傷治癒が行われないと，障害範囲が拡大して有害な心室リモデリングが進行する．心筋障害時には壊死領域で貪食・蛋白分解・炎症反応が起こる．炎症反応が終息に向かい，遊走してきた心臓線維芽細胞が蓄積して血管新生やコラーゲン沈着による瘢痕・肉芽組織が形成される．この一連の創傷治癒過程が適切な時期に始まり，炎症反応が長期間持続せず，適切に終息して瘢痕が成熟することが有害な心室リモデリングを生じさせないうえで重要とされる（van den Borne et al., 2010）．この過程を制御する心臓線維芽細胞が，心室リモデリングを予防するための標的となりうる．

心筋障害後の独立予後不良因子として，高齢，女性，糖尿病，心血管疾患の既往，心筋重量の上昇などが疫学的に報告されている (Ogawa and Kojima., 2009)．これらのリスク因子は，拡張不全 (heart failure with preserved ejection fraction; HFpEF) の背景因子でもあり，心筋組織が硬化 (stiffnessの上昇) している患者である．このことから，心筋組織の硬さと創傷治癒能の関連性が推測できる．

心筋組織内では伸展力，壁応力，ずり応力や静水圧など様々な力学的刺激が発生しており，これらの機械的刺激が細胞機能の制御に影響を及ぼすことが知られている．心筋組織の硬さ（stiffness）は組織内圧に相当する．心筋組織内に存在する細胞に着目すると，その周囲に接触する隣接細胞や細胞外基質から受容する等方向の力である．この等方向から受容する力は力学的に静水圧に相当する．硬化した病的心筋組織内では200mmHg程度までその圧が上昇している（Arani et al., 2017）．腫瘍組織において上昇した静水圧は，がん細胞の遊走や転移などを制御する重要な因子であることが知られている（Kao et al., 2017）．よって硬化した心筋組織内で上昇した静水圧が，心臓線維芽細胞の機能を制御する可能性が推測できる．

以上から当研究では，静水圧と心臓線維芽細胞が制御する創傷治癒過程に着目した検討を行い，心室リモデリングに対する新たな予防法を提案する事とした.

２．方法
培養ヒト心臓線維芽細胞（HCFs）を用いた．大気圧下培養と静水加圧下培養（100～200 mmHg）した HCFs を比較した．高気密性容器と真空ポンプを用いた加圧装置を新規に作成し，圧力計と温度計を用いて実験環境をモニタリングしながら静水加圧を行った. 3～8 時間の静水加圧後に mRNA を，24 時間静水加圧後にタンパク質を回収した．創傷治癒関連遺伝子の発現量を逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) 法）で評価した．創傷治癒関連タンパク質と細胞内シグナル伝達関連のタンパク質をウエスタンブロットとリン酸化抗体アレイを用いて評価した．細胞形態と alpha smooth muscle actin（α-SMA）の細胞内局在を蛍光免疫染色法で評価した．細胞収縮能はコラーゲンマトリックスを用いた 3 次元培養収縮アッセイで評価した．細胞増殖能・生存率はXTT アッセイを用いて評価した．

３．結果
通常培養下では線維芽細胞の活性化マーカーであるα-SMA が良好に発現していた．静水加圧下（ 200 mmHg ） ではα-SMA の発現が抑制された． さらに炎症性サイトカイン Interleukin(IL)-6，Tumor Necrosis Factor (TNF)-α，Ⅰ型コラーゲン，Ⅲ型コラーゲンの転写量が抑制された．この抑制効果は静水圧力および時間に依存的であった．蛍光免疫染色で観察すると，静水加圧でα-SMA 発現が有意に抑制され，細胞の形態変化が生じることが確認された. 3 次元培養を行うと，静水加圧群ではコラーゲンマトリックスの収縮過程が遷延した．また静水加圧は細胞増殖・生存能への影響は認めなかった．静水加圧刺激の細胞内シグナル伝達をリン酸化抗体アレイでスクリーニングすると Akt のリン酸化が顕著であった．ウエスタンブロットでも Akt のリン酸化は亢進しており, 圧力および時間依存性に亢進した．また GSK-3αのリン酸化亢進と p38，CREB のリン酸化抑制が認められた．薬理学的に Akt シグナルの阻害を行うと，静水加圧による Akt，GSK3-α， p38 の変化が抑制されたが CREB は変化しなかった．GiPCR である APJ 受容体を薬理学的に阻害すると，静水加圧による Akt，GSK-3α，p38，CREB のすべての変化が抑制された．さらにAPJ 受容体を阻害すると静水圧で抑制されたα-SMA, IL-6, 1 型コラーゲンの転写が回復した．

４．考察
静水加圧下では，通常条件では認められる心臓線維芽細胞の活性が抑制されていることが示唆された．心筋組織内圧が上昇した状態では，創傷治癒に関連するサイトカインや細胞外基質の産生が低下し，さらに瘢痕形成に重要な収縮能が障害されることが想定された．静水加圧は AC-cAMP-CREB 経路の抑制と PI3K-Akt-GSK-3 経路を活性し，さらに薬理学的検討から APJ 受容体が静水圧の上昇を感知することが推測された．心筋組織の硬化を反映する高静水圧下ではGiPCR の APJ 受容体が作動しており，それを阻害することで，創傷治癒関連の反応が回復することが示唆された．今後，心筋組織が硬化した動物モデルを用いた in vivo 系でのさらなる検討が必要である．

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参考文献

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