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Structural analysis of plant vacuolar iron transporter VIT1

加藤, 孝郁 東京大学 DOI:10.15083/0002004762

2022.06.22

概要

【背景・目的】
　鉄イオンは電子伝達系や酸素運搬、DNAの合成経路などに関わる補因子として機能している。一方で、鉄イオンは溶液中で容易に酸化還元され生体分子を直接傷付ける活性酸素を産出する。鉄イオンは必須な金属イオンであると同時に毒性をもっているため、細胞内の鉄イオンの濃度は厳密に制御されている。結合タンパク質や膜輸送体などによって細胞質の鉄イオン濃度は制御されており、植物細胞においては細胞小器官の液胞内に鉄イオンを隔離・貯蔵することでその濃度を維持している。液胞内への鉄イオンの輸送は液胞膜局在の鉄イオントランスポーターVacuolar Iron Transporter 1(VIT1)が主に担うことが知られている。VIT1は植物の発生時や生育時の鉄イオン恒常性に関わるほかに、近年では鉄含有量が向上した改変作物の開発に利用されている。また、マラリア原虫のVIT1相同遺伝子は宿主への寄生時に重要な役割があることが報告されている。したがって、VIT1の研究は植物の鉄イオン恒常性の更なる理解、特に発展途上国で深刻な鉄欠乏への改変作物を用いた治療、近年薬剤耐性が問題視されるマラリア原虫への新たな治療薬の開発に繋がることが期待される。しかし、VIT1はこれまでに立体構造が報告されたどのトランスポーターとも配列相同性を示さず、鉄イオンの認識機構や輸送サイクルなどの分子機構は不明であった。そこで、本研究ではVIT1の立体構造をX線結晶構造解析で決定し、得られた構造情報を基にVIT1の詳細な分子機構の解明を目指した。

【結果】
　精製したEgVIT1をリポソームに再構成し、二価カチオンのインヂケーターであるcalceinを用いて輸送活性を評価した。その結果、EgVIT1は鉄イオンを輸送する事、鉄イオンの輸送にはリポソーム膜を介したH+勾配が必要であるアンチポーターであることを解明した。EgVIT1を脂質キュービック相法による結晶化を行い、分解能2.7Åで決定する事に成功した。EgVIT1は二量体を形成した新規の構造を有する立体構造であった。各単量体は5本の膜貫通ヘリックスで構成されたTransMembrane Domain(TMD)と細胞質側に局在し、4本のヘリックスで構成され結晶化時に添加した亜鉛イオンが結合したMetal Binding Domain(MBD)の2つのドメインで形成されている。
　TMDにおいて、二量体の界面には細胞質側に開いた親水性のポケットを有していた。この親水性ポケットはVIT1ファミリー間で保存性の高いアスパラギン酸やグルタミン酸、チロシンそしてメチオニンによって構成されていた。これらアミノ酸の変異体をリポソームに再構成し輸送活性を測定した結果、鉄イオンの輸送活性は著しく減少した。さらに、EgVIT1の結晶に輸送基質の1つであるコバルトイオンを浸潤させた結果、VIT1ファミリー間で完全に保存され親水性ポケットの細胞質側入り口に局在するアスパラギン酸とメチオニンがコバルトイオンを配位する事を結晶学的に明らかにした。コバルトイオンの結合に伴うTMDの構造変化には、保存性の高いグリシン残基やプロリン残基が寄与しており、これら変異体の輸送活性は低下した。
　次に、MBD単独の結晶を調製し輸送基質を含む複数種の金属イオンを浸潤させ、X線回折実験を行ったところ、保存性の高い5つのグルタミン酸と2つのメチオニンが金属イオンを配位する事を明らかにした。これらアミノ酸の変異体をリポソームに再構成したところ、輸送活性は著しく減少した。

【考察】
　液胞内腔は金属イオンの濃度が高く、VIT1が液胞内へ鉄イオンを輸送するためには駆動力が必要である。液胞は細胞質より酸性な環境であるため、VIT1がH+と共役するアンチポーターであることは液胞内外の環境に適した輸送機構であると考えられる。TMDには親水性のポケットが確認され、構成するアミノ酸の変異は輸送活性を著しく低下させた。したがって、このポケットは金属イオンの輸送経路であると考えられる。本研究から、MBDの金属結合部位も輸送に重要であることが示唆された。MBDは遊離した二価鉄イオン「捕え」、TMDによる「運ぶ」機能を促進していると考えられる。このような輸送様式は溶液中で不安定な鉄イオンを効率的に液胞に輸送するために植物が獲得した機構であると考えられる。

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