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Characterization of hiPSC-Derived Muscle Progenitors Reveals Distinctive Markers for Myogenic Cell Purification Toward Cell Therapy

Harutiun, Minas Nalbandian Geymonat 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23412

2021.07.26

概要

骨格筋の再生の際には、サテライト細胞(SC)と呼ばれる生体の幹細胞が重要な役割を果たしている。デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)などの筋疾患に対する再生医療として、健常ドナーからのSC の移植が研究されてきた。しかし、SC をin vitro で拡大培養すると、SC の筋再生能力が失われてしまい、実際の臨床研究では治療効果が見られなかった。一方、ヒト iPS 細胞(hiPSCs)は、無限の増殖能を持ち様々な細胞系統に分化させることができるため、筋再生医療に適した筋前駆細胞(MuPCs)を誘導するための魅力的な細胞源と考えられている。

実際、hiPSC からMuPCs を得るためのin vitro 分化システムの開発がこれまでにいくつか報告されている。hiPSC 由来の MuPCs(iPSC-MuPCs)は、骨格筋への移植後に筋再生能力を示すが、hiPS 細胞から分化した細胞集団には神経細胞や間葉系細胞などの非筋原性細胞が含まれており、hiPS 細胞由来のすべての細胞が筋原性系統の細胞ではないことが示されている。そのため表面マーカーを用いて標的細胞を純化することが解決策となる。hiPSC-MuPCs の発生段階が成人骨格筋組織のそれとは異なることが知られているため、ヒトSC のための既知の表面マーカーはhiPSC-MuPC の純化には適していない可能性がある。本研究の目的は、hiPSC-MuPCs の特徴を明らかにし、細胞治療に向けた適切な細胞純化のための新しい表面マーカーを見つけることである。

まずSC とMuPCs で発現する2 つの最も重要な転写因子(MYF5 とPAX7)を可視化するため、MYF5-tdTomato とPAX7-Venus という2 つの異なるレポーターhiPS 細胞株を樹立した。MYF5 陽性細胞およびPAX7 陽性細胞をフローサイトメトリーにより純化し、分化の 42 日目(初期段階)と 84 日目(後期段階)で各陽性細胞の性状を解析した。免疫不全DMD モデルマウスへの移植実験の結果、後期の細胞は筋再生能が高いことが明らかになり、トランスクリプトーム解析の結果、後期の細胞は胎児の MuPC に近いことが明らかになった。さらに、PAX7+細胞は神経前駆細胞マーカーも発現しており、MYF5+細胞はより純粋なhiPSC-MuPC 集団であることが示唆された。

そこで、hiPSC-MuPC 特異的な表面マーカーをスクリーニングとしてMYF5 陽性細胞と陰性細胞の網羅的遺伝子発現解析を比較し候補を選別した後、骨格筋発生アトラスデータベースにより候補表面マーカーを分析した結果、hiPSC-MuPC 純化のための2 つの特異的かつ新規な細胞表面マーカーを同定した。CDH13 とFGFR4 である。

CDH13 陽性細胞およびFGFR4 陽性細胞は、免疫不全DMD モデルマウスへの移植実験により高い筋再生能力を示した。また既知の表面マーカーと比較して、PAX7 陽性細胞の濃縮率が高いことも明らかとなった。遺伝子発現解析により、CDH13 は筋芽細胞を含む筋原生細胞全般のマーカーであるのに対し、FGFR4 は PAX7 陽性 MYF5 陽性の筋幹細胞に発現するマーカーであることが示唆された。最後に、MYF5 は CDH13 プロモーター領域の2 つの部位に直接結合することで、CDH13 の発現制御に直接かかわっていることが証明された。

以上のように、本研究により hiPSC-MuPCs の純化のための 2 つの新しい表面マーカ―が同定された。この成果は再生医療用 iPS 細胞ストックを用いた筋再生医療の実現に貢献するものと期待される。

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参考文献

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