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魚類骨格筋および卵母細胞への遺伝子・タンパク質導入法の開発

岩泉 雅樹 東北大学

2021.03.25

概要

最近開発されたCRISPR/Cas9法やTALEN法などのゲノム編集技術により、非モデル生物においてもゲノム情報を簡便に改変することが可能になり、農畜水産分野にも利用され始めている(Goto et al., 2019; Gratacap et al., 2019)。水産増養殖分野においては、通常よりも可食部の筋肉量が多いマダイやヒラメなどが作出されている(Kim et al., 2019; Kishimoto et al., 2018)。また、マグロにおいては、衝突死を防ぐために遊泳速度の遅い系統が作出されており(Higuchi et al., 2019)、ゲノム編集を利用した新品種の開発が始まっている。

　CRISPR/Cas9法では、guideRNAがゲノム上の標的配列に結合し、その部分をCas9ヌクレアーゼが切断する。TALEN法では、DNA結合ドメインで標的配列に結合し、FokIヌクレアーゼがDNAを切断する。切断された部位が非相同組み換えによって修復される際に多発する塩基の挿入や欠損により、タンパク質の読み枠がずれることを利用して遺伝子ノックアウト(KO)を行う(Christian et al., 2010;Jinek et al., 2012)。

　魚類でのゲノム編集は、gRNAとCas9を顕微注入で受精卵に導入する方法が一般的である。しかし、顕微注入には、熟練した技術が必要であることや、卵内に海水由来のイオンが流入して生残率が低いこと、一細胞期という限られた時間の中で大量の受精卵を処理しなければならないなどの問題点がある。また、卵膜が硬く顕微注入が困難な魚種やそもそも受精卵を得ることが困難な魚種も少なくない。さらに、養殖魚の場合は、世代時間が長いため、種苗として出荷可能なホモの変異体を得るのに10年程度の長い年月を要する事も障壁となっている。

　これらの諸問題を克服するために、本研究では、雌親魚の卵巣内卵母細胞にgRNAとCas9を導入してゲノム編集を行うことを着想した。卵母細胞にゲノム編集コンポーネントを導入できれば、煩雑な顕微注入を回避することができ、また受精卵内で卵由来と精子由来のゲノム両方を改変することによりF0でホモの変異体を得て、養殖魚におけるゲノム編集を大幅に効率化することに貢献できるのではないかと考えている。卵母細胞でゲノム編集を行う戦略としては、既に蚊において、卵黄タンパク質の取り込み機構を利用したゲノム編集が行なわれている(Chaverra-Rodriguez et al., 2018)。アフリカツメガエルにおいては、ビテロジェニン受容体結合配列を付加したストレプトアビジンとビオチン標識したDNAを結合させて卵母細胞に導入したという報告がある(Rungger et al., 2017)。また、マウスにおいては受精卵を体外でエレクトロポレーション(EP：electroporation) し、ゲノム編集する方法や卵管内の受精卵にEPしてゲノム編集する方法が開発されている(Hashimoto et al., 2016; Ohtsuka et al., 2018; Takahashi et al., 2015)。i-GONAD法((improved-Genome editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery)では、簡便にゲノム編集を行うことができ、習熟した技術が必要な受精卵への顕微注入に代わって、ゲノム編集の標準的な導入法として世界中で採用されつつある。魚類では、水泡眼のビテロジェニンをゼブラフィッシュの卵母細胞に導入した報告や、メダカにおいてビテロジェニンとGFPの融合タンパク質を肝臓から分泌させて受精卵に導入したという報告がある(Matsuda et al., 2011; Murakami et al., 2019)。しかし、顕微注入を用いないゲノム編集方法はまだ開発されておらず、技術開発により様々な魚種への応用が期待される。

　本研究は、受精卵への顕微注入を用いないゲノム編集技術の開発に向けて、第一章に記述した「魚類骨格筋へのEPを利用した組換えタンパク質の血液への分泌および受精卵への導入」と第二章に記述した「卵巣への注射(IMO：injection into the mother’s ovary)によるタンパク質の導入」の2つの方法により実験を行った。第一章では、ゼブラフィッシュの骨格筋に分泌型ルシフェラーゼを発現するベクターをEPで導入したところ、受精卵においてルシフェラーゼ活性が検出できた。このことから、筋細胞から血液中にタンパク質を分泌させて受精卵に導入することは可能であることがわかった。また、ゼブラフィッシュの卵巣にCMV:GFPをEPで導入する実験を行った。GFP蛍光は、濾胞細胞で確認できたが、卵母細胞自体では蛍光が確認できなかった。第二章では、GFPとルシフェラーゼの融合タンパク質(GFP-Luc)をゼブラフィッシュの卵巣に注射した後、受精卵を得る実験を行った。注入したタンパク質に由来するGFP蛍光は受精卵の卵黄において検出できた。このことから、ゼブラフィッシュの卵母細胞は非特異的にタンパク質を取り込む性質があることがわかった。次に、蛍光標識したgRNAとCas9タンパクの複合体(RNP)を卵巣に注射し、受精卵を得たところ、卵黄で蛍光を検出できた。しかし、ゲノム編集による変異導入は確認できなかった。卵黄中のタンパク質は、卵黄顆粒内（エンドソーム）に封入されている可能性が考えられる。Chaverra-Rodriguez et al(2018)の蚊の報告では、エンドソームを破壊するためにクロロキンを用いてゲノム編集を行っていた(Chaverra-Rodriguez et al., 2018)。本研究では、ゼブラフィッシュ受精卵のクロロキン溶液に対する耐性も調べた。

　今後は、クロロキンなどのエンドソーム破壊剤などを用いるなど、RNPを卵黄顆粒から解放する方法を検討する必要がある。

　本研究では、第一章、第二章を通して、顕微注入せずに卵母細胞経由で受精卵に組換えタンパク質を導入することに成功した。この成果は、受精卵への顕微注入を用いないゲノム編集の実現に近づいたと言える。

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参考文献

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