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All-Trans Retinoic Acid Exhibits Antiviral Effect against SARS-CoV-2 by Inhibiting 3CLpro Activity

森田 武志 横浜市立大学

2022.03.25

概要

1. 序論
新型コロナウイルス (SARS-CoV-2) は重症な呼吸器症候群である新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) を引き起こすウイルスとして, 2019 年 12 ⽉に中華⼈⺠共和国, 湖北省,武漢市で存在が報告された(Wang et al., 2020; Zhu et al., 2020). その感染は世界中で広がっている. 現在もなお, 世界的に患者数は増加しており, 公衆衛⽣上, 最も⼤きな課題となっている. しかしながら, COVID-19 に対する抗ウイルス薬やその症状に応じた治療薬として承認されている薬剤は少なく, その開発が求められている.
SARS-CoV-2 は 2 種類のプロテアーゼを⾃⾝のゲノムにコードしており, その⼀つである 3C 様プロテアーゼ (3CLpro)はメインプロテアーゼとも呼ばれ, SARS-CoV-2 の複製過程において, ポリタンパク質を切断し, RNA 依存性 RNA ポリメラーゼなどの機能をもつタンパク質とする, 重要な役割を果たすプロテアーゼである. SARS-CoV-2 のもつ 3CLpro は SARS-CoV のそれと⽐べ, アミノ酸配列で 96% の相同性を持ち, コロナウイルス間で広く保存されている.これらの理由から, SARS-CoV-2 の複製を抑える有効な治療薬の標的として注⽬されており(Anand et al., 2003; Zhang et al., 2020), その阻害剤の開発が試みられている. 3CLpro の阻害作⽤をもつ候補化合物の阻害活性の評価には, これまで, 蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）法が広く⽤いられており, いくつか抗ウイルス作⽤を⽰すとしての報告がある(Jin et al., 2020; Vuong et al., 2020; Zhang et al., 2020). しかし未だにどの薬剤も臨床承認はなされていない. このことから, より多くの候補化合物を選択するために, FRET よりも感度が良く, 3CLpro の阻害活性を検出できる系の構築が必要である.AlphaScreen 法はFRET 法よりも感度が良く, また, ダイナミックレンジを検出することのできる評価法という報告がある(Glickman et al., 2002).
そこで本研究では, SARS-CoV-2 3CLpro の阻害活性を, AlphaScreen の技術を⽤いてハイスループットに検出できる評価系の構築を⾏なった. その後, この評価系を⽤いて, 3CLproの阻害活性を持つ化合物の探索を⾏い, その抗ウイルス作⽤についても検討を⾏なった.


2. 実験材料と⽅法
コムギ無細胞タンパク質合成系を⽤いて 3CLpro により切断される基質(Nsp4/Nsp5を含むペプチド)を合成し, 3CLpro, 候補化合物を混合し, 反応させた後に AlphaScreen の技術を⽤いて発光シグナルの強度を指標に阻害作⽤の評価を⾏える系の構築を⾏なった.また, 評価系の⽐較として, 同じ化合物セットを⽤いて, FRET 法による評価も⾏なった.その後, 阻害作⽤の確認された化合物について, 濃度勾配を作成し, 50 %阻害濃度 (IC50)を算出した. さらに, その阻害様式の検討として, 3CLpro との結合部位をドッキングシュミレーションにて予測した. 得られた化合物の SARS-CoV-2 に対する抗ウイルス作⽤として VeroE6/TMPRSS2 細胞を⽤いて, CellTiter-Glo を⽤いた細胞⽣存率と RT-PCR による培養液中に存在するウイルス RNA 数を測定した. さらに SARS-CoV-2 ヌクレオタンパク質(N)に対する抗体を⽤いて免疫染⾊を⾏うことで感染細胞の減少を確認した. そして, 化合物の抗ウイルス作⽤を⽰す過程を予測するために, 異なる時期に化合物を添加する検討を⾏なった. また, ヒト肺上⽪細胞由来の細胞である Calu-3 細胞を⽤いても抗ウイルス作⽤と細胞毒性について検討を⾏なった. さらに, 変異を懸念される変異株である, α, β, γ, δ株においても抗ウイルス作⽤の検討を⾏なった.

3. 結果
本研究で構築した評価系を⽤いて 3CLpro の阻害活性を持つ化合物を探索し, 複数の阻害活性を持つ化合物を得た. 同じ化合物セットを FRET 法による評価系と⽐較したところ, FRET よりもシグナルに対するバックグラウンドの⽐(S/N ⽐)よく, より多くの化合物で阻害活性を評価できた. その中で最も活性が⾼い化合物として All-trans- retinoic acid (ATRA)を⾒出した. ATRA の 3CLpro に対する阻害能は IC50= 24.7 ± 1.65 μM であった. ウエスタンブロッド法でも基質の切断バンドを確認したところ ATRA 10 μM までは切断バンドが検出されたが, 25 μM では基質の切断は阻害されたことが確認された. ドッキングシミュレーションにおいても 3CLpro の 190 番⽬のスレオニンと 2 つの
⽔素結合をすることで相互作⽤し, 活性部位である 145 番⽬のシステインと 41 番⽬のヒスチジンを覆うように ATRA が結合することが予測された.
抗ウイルス作⽤の検討としてまず初めに VeroE6/TMPRSS2 細胞を⽤いて, SARS-CoV- 2 感染により誘発される細胞死と培養上清中のウイルス RNA コピー数を指標に抗ウイルス作⽤を評価したところ, 細胞死の阻害は IC50=8.09 ± 0.06 μM, コピー数は IC50=2.69 ±
0.09 μM で有意に複製を阻害することが⽰された. また、ヒトの肺上⽪細胞由来の細胞である Calu-3 細胞を⽤いた抗ウイルス作⽤の検討においても IC50=0.82 ± 0.01 μM で有意にウイルスのコピー数を減少させた.さらに, 懸念される変異株である(variant of concern: VOC) に指定されている Alpha, Beta, Gamma, Delta 株においても検討を⾏い, IC50< 1 μM で有意にウイルスのコピー数を減少させた.

4. 考察
本研究により AlphaScreen を⽤いた新たな 3CLpro 阻害活性評価系を構築し, それを⽤いてスクリーニングを⾏うことで 3CLpro に対して阻害作⽤を⽰す化合物として ATRA を⾒出した. さらに, ATRA が SARS-CoV-2 の複製を阻害する働きがあることが⽰され, VOC に対してもその作⽤を⽰した. 本研究で⽤いた VOC は 3CLpro のアミノ酸変異は 1つのみであり、活性部位への変異は認められず、保存されていることが分かった。以上のことより、3CLpro は SARS-CoV-2 の複製の制御に優れた薬剤標的であり、ATRA は新たな治療薬の候補になりうると考えられた。

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参考文献

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