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Colorectal cancer-derived CAT1-positive extracellular vesicles alter nitric oxide metabolism in endothelial cells and promote angiogenesis

Ikeda, Atsushi 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23411

2021.07.26

概要

大腸癌は早期発見・早期治療により予後の改善が見込まれ、早期発見を可能にするバイオマーカー開発が求められている。臨床的に広く使用されるCEA や、便検査は感度・特異度ともに低く、一方、高感度な大腸内視鏡検査は侵襲的であることから、高感度かつ低侵襲なリキッドバイオプシーによる診断技術の開発が求められる。細胞外小胞（Extracellular vesicle, EV）は細胞より血液や尿などの体液中に放出される小胞である。EV には放出細胞由来の情報が含まれ、リキッドバイオプシーによる診断に有用であるという報告が数多くなされている。

本研究では、EV を利用したリキッドバイオプシーによる大腸癌診断法を開発するため、手術切除後の新鮮な組織（大腸癌原発巣、近傍正常腸管、n = 17）を無血清培地で培養し、その培養上清より得られた組織由来細胞外小胞（Tissue-exudative extracellular vesicles:Te-EVs）を用い網羅的プロテオーム解析を行った。同組織ペア（大腸癌原発巣、近傍正常腸管）よりタンパク質を抽出して得られた組織プロテオームと比較すると、EV マーカーである tetraspanin family タンパク質(CD9, CD63)に加えて、Vacular protein sorting(VPS)タンパク質群が有意に多く含まれており、新たな EV マーカータンパク質の候補となりえることが示唆された。

同定された6,307 のTe-EV タンパク質のうち、正常腸管Te-EV と比較し腫瘍Te-EV が有意（補正p < 0.05）に、かつ5 倍以上発現しているものを487 個認めた。そのうち膜タンパク質であり、かつ大腸癌と強い関連性が報告されている、high affinity cationic aminoacid transporter 1 (CAT1) (p = 5.0 ×10-3、fold change = 6.2) に着目した。健常者血漿25例、大腸癌患者血漿94 例を用いたEV-CAT1 sandwich ELISA の結果、大腸癌患者を有意に識別可能であった（p = 3.8 ×10-7）。

CAT1 は細胞外アルギニンを細胞内へ輸送する主要なトランスポーターであり、アルギニンは血管新生の重要な調節因子である一酸化窒素（NO）の基質である。大腸癌組織および近傍正常腸管におけるCAT1および血管内皮細胞マーカーCD31の発現を免疫組織化学染色により検討したところ、大腸癌組織内あるいは近傍の血管内皮細胞が近傍正常腸管組織の血管内皮細胞よりも有意にCAT1 高発現であった。CAT1 高発現EV を血管内皮細胞に添加すると、EV が細胞内に取り込まれ、また EV 取り込みを介して細胞膜で外来性CAT1 が発現することが確認された。さらにCAT1 高発現EV 添加により血管新生細胞の増殖および管腔形成が促進された。

CAT1 を高発現させた血管内皮細胞ではNO の代謝産物（アルギニン、cGMP）の上昇が認められ、既知の NO/cGMP 経路による血管新生が誘導されていると示唆された。最後に、CAT1 高発現EV を添加した血管内皮細胞内でcGMP の上昇を認め、より生理学的なモデルにおいて同経路が誘導されることが支持された。

以上よりCAT1 内包細胞外小胞は大腸癌診断に有望なバイオマーカーであり、また大腸癌の新しい治療戦略開発の標的ともなり得ることが示唆された。

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