リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

リケラボ 全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索するならリケラボ論文検索大学・研究所にある論文を検索できる

大学・研究所にある論文を検索できる 「Local application of Usag-1 siRNA can promote tooth regeneration in Runx2-deficient mice」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。
リケラボ

コピーが完了しました

URLをコピーしました

論文の公開元へ論文の公開元へ
書き出し

Local application of Usag-1 siRNA can promote tooth regeneration in Runx2-deficient mice

Mishima, Sayaka 京都大学 DOI:10.14989/doctor.r13462

2022.01.24

概要

siRNA は疾患の原因となる遺伝子を特異的かつ直接的に攻撃できる核酸医薬として注目されている。標的臓器や標的細胞内へ選択的に送達するためにはDDS (Drug Delivery Sysem) の選択が重要であり、本研究ではカチオン化ゼラチンを用いた。

歯数は遺伝子により厳密に制御されており、歯数異常の発生機序を検討し、その遺伝子を制御することで歯数をコントロールできると考えられている。そのひとつに USAG-1 があり、Usag-1 欠損マウスは上顎の痕跡的乳切歯が過剰歯として萌出する。一方、Runx2はマウスにおいては継続歯になる能力を持ったlingual bud の形成を抑制することで、歯牙欠損モデルマウスとなる。これまでの研究でマウスの歯胚形成時においてはUsag-1 と Runx2 が拮抗作用を示すことをすでに確認している。

そこでカチオン化ゼラチンをDDS として用いたUsag-1siRNA の局所応用は、Runx2 欠損マウスの歯の発生過程において歯数制御に関与するという仮説を立てて検証した。 まず、野生型マウス下顎歯胚のみと野生型マウス下顎歯胚にPBS 含浸カチオン化ゼラチンを添加し腎被膜下移植を行ったところ、ともに19 日後に歯牙形成を認めた。このことからカチオン化ゼラチンは腎被膜下移植において下顎歯胚への為害作用を認めないことが示された。また、移植後3、6、10 日の切片をAlexa 免疫染色にて評価したところ多数の陽性細胞を確認できた。これらの結果から、siRNA の局所投与においてカチオン化ゼラチンに徐放性があり、DDS として有用であることが示された。

次に siRNA のノックダウン効果を確認するために、トランスフェクションを行い、 Sq-PCR にて評価した。エナメル上皮幹細胞であるmHAT9d へsiRNA をトランスフェクションしたところ、48 時間後に Usag-1 の著しい発現抑制を認めた。また、野生型マウスE10 下顎歯胚の器官培養にてsiRNA を添加したところ 10 日後にUsag-1 の著しい発現抑制を認めた。そこで、野生型マウス E10 下顎歯胚の器官培養において Usag-1、 Runx2 の siRNA を添加し 10 日後の連続切片を HE 染色し歯胚形態を観察した結果、 Usag-1siRNA を添加投与すると歯胚形成ステージが進行し、歯胚数も増加する傾向が示された。一方、Runx2siRNA を添加投与した際には歯胚数が減少する傾向が示された。これらのことから器官培養においてsiRNA は歯胚形成ステージの進展および歯胚数形成の増減をコントロールすることができる核酸医薬であることが示唆された。

次にvivo における Usag-1、Runx2 のsiRNA の効果を確認するためにsiRNA 含浸カチオン化ゼラチン投与下での野生型マウス E10 下顎歯胚の腎被膜下移植を行い検討した。 19 日後の切片のHE 染色およびμCT での歯数評価にてUsag-1siRNA は歯数の増加傾向が、Runx2siRNA は減少傾向が認められた。また、Runx2siRNA による歯の形成障害の発現は、Usag-1siRNA＃903 では回復されない一方で、Usag-1siRNA＃304 では回復した。これらの結果から、Usag-1siRNA＃304 は歯牙形成を促しうる核酸医薬であることが示唆された。

また、野生型マウス歯胚のみと野生型マウス歯胚をPBS 含浸カチオン化ゼラチンとともに腎被膜下移植したところ歯牙様組織の形成を認めたが、Runx2KO マウス歯胚のみと Runx2KO マウス歯胚と PBS 含浸カチオン化ゼラチンの腎被膜下移植では歯牙様組織の形成は認めなかった。すなわち Runx2KO マウスの表現型として歯の発生が遅延し、途中で停止することが確認できた。

そこで、Runx2KO マウス歯胚を Usag-1siRNA＃304 含浸カチオン化ゼラチンとともに腎被膜下移植したところ、歯牙様組織の形成を42.3％認めた。μCT にて評価を行ったところ石灰化を伴わない軟組織の形成が確認できた。Sq-PCR ではエナメル基質である Amelex 、Amelobrastin の発現を認め、切片の免疫染色においても、Amelogenin 陽性細胞を多数確認し、エナメル芽細胞が発現していた。以上から、Usag-1siRNA＃304 は Runx2KO マウスの表現型を回復できることが示唆され、歯牙形成促進をする核酸医薬の候補の可能性が示された。

論文の公開元へ

この論文で使われている画像

関連論文

関連論文をもっと見る

参考文献

1. Ardakani, F. E., Sheikhha, M. & Ahmadi, H. Prevalence of dental developmental anomalies: A radiographic study. Commun. Dent. Health 24, 140–144 (2007).

2. Machida, J. et al. Genetic epidemiology of tooth agenesis in Japan: a population- and family-based study. Clin. Genet. 88, 167–171 (2015).

3. Machida, J. et al. WNT10A variants isolated from Japanese patients with congenital tooth agenesis. Hum. Genome Var. 4, 17047. https://doi.org/10.1038/hgv.2017.47 (2017).

4. Chhabra, N., Goswami, M. & Chhabra, A. Genetic basis of dental agenesis–molecular genetics patterning clinical dentistry. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 19, e112–e119 (2014).

5. Callea, M., Fattori, F., Yavuz, I. & Bertini, E. A new phenotypic variant in cleidocranial dysplasia (CCD) associated with mutation c.391C>T of the RUNX2 gene. BMJ Case Rep. https://doi.org/10.1136/bcr-12-2011-5422 (2012).

6. Murashima-Suginami, A. et al. Rudiment incisors survive and erupt as supernumerary teeth as a result of usag-1 abrogation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 549–555 (2007).

7. Murashima-Suginami, A. et al. Enhanced bmp signaling results in supernumerary tooth formation in usag-1 deficient mouse. Biochem. Biophys. Res. Commun. 369, 1012–1016 (2008).

8. Togo, Y. et al. Antagonistic functions of usag-1 and runx2 during tooth development. PLoS ONE 11, e0161067. https://doi.org/10. 1371/journal.pone.0161067 (2016).

9. Kiso, H. et al. Interactions between BMP-7 and USAG-1 (uterine sensitization-associated gene-1) regulate supernumerary organ formations. PLoS ONE 9, e96938. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096938 (2014).

10. Novina, C. D. & Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature 430, 161–164 (2004).

11. Soutschek, J. et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432, 173–178 (2004).

12. Finkel, R. S. et al. Treatment of infantile-onset spinal muscular atrophy with nusinersen: a phase 2, open-label, dose-escalation study. Lancet 388, 3017–3026 (2016).

13. Rinaldi, C. & Wood, M. J. A. Antisense oligonucleotides: The next frontier for treatment of neurological disorders. Nat. Rev. Neurol. 14, 9–21 (2018).

14. Jo, J. I., Gao, J. Q. & Tabata, Y. Biomaterial-based delivery systems of nucleic acid for regenerative research and regenerative therapy. Regen. Ther. 11, 123–130 (2019).

15. Kleinman, M. E. et al. Sequence- and target-independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3. Nature 452, 591–597 (2008).

16. White, P. J. Barriers to successful delivery of short interfering RNA after systemic administration. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 35, 1371–1376 (2008).

17. Saito, K. et al. Loss of stemness, EMT, and supernumerary tooth formation in Cebpb-/-Runx2+/- murine incisors. Sci. Rep. 8, 5169. https://doi.org/10.1038/s41598-018-23515-y (2018).

18. Hornung, V. et al. Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Nat. Med. 11, 263–270 (2005).

19. Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806–811 (1998).

20. Zimmermann, T. S. et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature 441, 111–114 (2006).

21. Eguchi, A., Du Jeu, X. D. M., Johnson, C. D., Nektaria, A. & Feldstein, A. E. Liver Bid suppression for treatment of fibrosis associ- ated with non-alcoholic steatohepatitis. J. Hepatol. 64, 699–707 (2016).

22. Wu, Z. et al. Identification of small interfering RNAs which inhibit the replication of several Enterovirus 71 strains in China. J. Virol. Methods 159, 233–238 (2009).

23. Kishiya, M. et al. A functional RNAi screen for Runx2-regulated genes associated with ectopic bone formation in human spinal ligaments. J. Pharmacol. Sci. 106, 404–414 (2008).

24. Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A. & Tabata, Y. Delivery of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor by cationized gelatin to prevent interstitial renal fibrosis. J. Control. Release 105, 318–331 (2005).

25. Adams, D. et al. Patisiran, an RNAi therapeutic, for hereditary transthyretin amyloidosis. N. Engl. J. Med. 379, 11–21 (2018).

26. Takahashi, K. et al. Feasibility of molecularly targeted therapy for tooth regeneration. In New trends in tissue engineering and regenerative medicine: official book of the Japanese Society of Regenerative Medicine (eds Hibi, H. & Hueda, M.) 55–65 (Intech, 2014).

27. Gaide, O. & Schneider, P. Permanent correction of an inherited ectodermal dysplasia with recombinant EDA. Nat. Med. 9, 614–618 (2003).

28. Casal, M. L. et al. Significant correction of disease after postnatal administration of recombinant ectodysplasin A in canine X-linked ectodermal dysplasia. Am. J. Hum. Genet. 81, 1050–1056 (2007).

29. Kushibiki, T., Tomoshige, R., Fukunaka, Y., Kakemi, M. & Tabata, Y. In vivo release and gene expression of plasmid DNA by hydrogels of gelatin with different cationization extents. J. Control. Release 90, 207–216 (2003).

30. Kushibiki, T., Matsumoto, K., Nakamura, T. & Tabata, Y. Suppression of the progress of disseminated pancreatic cancer cells by NK4 plasmid DNA released from cationized gelatin microspheres. Pharm. Res. 21, 1109–1118 (2004).

参考文献をもっと見る