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Pathway-Oriented Screening法による生細胞の代謝活性の評価とその阻害剤の探索

柳, 光一 東京大学 DOI:10.15083/0002005187

2022.06.22

概要

大規模化合物ライブラリーを用いたハイスループットスクリーニング(HTS)は、細胞の表現型を制御し、疾患を治療する化合物を開発する上で非常に強力な手法である。これら小分子化合物の主な標的は酵素であるが、生細胞内の酵素活性はタンパク質同士の相互作用や翻訳後修飾、基質や補因子の濃度変化等によって複雑に制御されているため、その活性を正しく評価するには、invitroよりも生細胞系での評価が望ましいと考えられる1。特定の酵素活性を可視化する有機小分子蛍光プローブは、生細胞の代謝活性を評価する優れたツールとしてHTS系の開発に広く用いられてきた。しかしながら、糖やアミノ酸及びその代謝物などの生体内小分子に対してリン酸化や脱炭酸、異性化反応等を行う酵素については、その活性を可視化する蛍光プローブを基質アナログとして開発することは難しく、生細胞系で評価する実験系はこれまでにほとんど開発されていない。このような活性評価が困難な酵素に対して生細胞系で有効な阻害剤を取得するため、本研究では、①生細胞を用いて、ある代謝経路全体を標的とし、②この標的代謝経路を経て産生される小分子代謝物をカップルドアッセイによって選択的に蛍光検出する、という新たな生細胞ベースのHTS系を構築することを目指した。①について、ある基質をinputとして生細胞に添加後、代謝されて細胞外に放出された代謝物をoutputとして検出し、そのoutput量をinputとoutputの間に介在する代謝経路の活性として評価することを考えた(Fig. 1)。このoutput量を減少させるような化合物は、標的代謝経路に関わる酵素活性を阻害すると期待される。②について、outputの細胞外代謝物と選択的に反応する酸化還元酵素を用いてNAD(P)HやH2O2に変換し、これらと反応して蛍光上昇を示す蛍光プローブを開発することによりin situで選択的に細胞外代謝物を検出することを考えた。このような、①と②を組み合わせて代謝経路を標的として、生細胞系で標的代謝経路に関わる酵素活性を阻害する化合物を取得するHTS系をPathway-Oriented Screening(POS)と名付け、本研究ではその実証実験を行った。

[本論]
(A) 細胞外代謝物検出蛍光プローブの開発
カップルドアッセイに用いる蛍光色素が細胞内へ透過し、酸化還元反応を起こすと目的の細胞外代謝物に由来しない蛍光上昇を示すと考えられる。従って、水溶性を高め細胞膜透過性を低下させることで、細胞外に留まり、特定の細胞外代謝物を選択的に蛍光検出することが可能な新規NADH検出蛍光プローブおよびH2O2検出蛍光プローブを開発した(Fig. 2a, 2c)。本プローブを用いて、L-lactate、glucoseをそれぞれL-lactatedehydrogenase、glucose oxidaseによりNADHおよびH2O2へ変換することで、細胞共存下においても選択的に検出可能であることが示された(Fig. 2b, d)。

(B) Methylglyoxal(MG)代謝系阻害剤の探索
開発したアッセイ系を用いてがんで亢進している代謝活性を評価することとし、特にMG代謝系、アミノ酸代謝系についてこれらを制御して抗がん作用を示す化合物を探索した。MGは解糖系の副生成物として生じる代謝物であるが、反応性の高いジカルボニル構造がタンパクや核酸と反応するためMGは高濃度で細胞死を導くことが知られている。解糖系が亢進しているがんではこれに比してMGの産生も増加すると考えられるが、多くのがんでは、MGを無害なD-lactateへ代謝するMG代謝系の亢進がその防御に寄与していると考えられている。特に、MG代謝系の酵素群の活性は肺がんで亢進しており、難治性の肺小細胞がんの創薬標的になりうることが報告されている2。そこでMGをinput、D-lactateをoutputとし、outputのD-lactateをFig. 3aに示すカップルドアッセイによりin situで検出するPOS系を構築し、東京大学創薬機構提供の9600化合物からMG代謝系阻害剤を探索した(Fig. 3b)。得られたヒット化合物のうち、化合物1はがん細胞(DMS273)で特に強い増殖抑制効果を示し(Fig. 3c)、MG代謝系酵素glyoxalase1(GLO1)の代謝物S-D-lactoylglutathione(SLG)およびGLO1の補因子glutathione(GSH)の細胞内量を減少させていた(Fig. 3d)。化合物1は細胞内GSHを減少させることでMG代謝系を抑制し、がん選択的に増殖抑制効果を示すことが示唆された(Fig. 3e)。

(C) アミノ酸代謝系(Gln->Asn)阻害剤の探索
これまでの検討から適切なinputとoutputを定めることで、がんで亢進している代謝活性を評価可能であることが確かめられた。そこで、本アッセイ系をより広範な代謝活性の評価系へ発展させるため、がんに特徴的なinputとoutputの組み合わせを探索することを可能にする実験系を開発した。特にアミノ酸代謝に着目し、各アミノ酸をinputとして細胞に添加した後、細胞外に放出されたoutputのアミノ酸を測定することで、正常細胞とがん細胞で違いの見られるinputとoutputの組み合わせを複数見出すことに成功した(Fig. 4a)。特に、L-glutamine(Gln)を添加した後、細胞外へ放出されるL-asparagine(Asn)の量が正常細胞(NHBE)と比較してがん細胞(A549)で増加しており、Gln->Asnという代謝経路が亢進していると考えられた(Fig. 4b)。がんは様々な代謝活性が亢進しているが、その1つに、ATP産生をグルタミン代謝に大きく依存する性質が知られており3、これを阻害する化合物は抗がん作用を示すことが期待される。そこでinputをL-glutamine、outputをL-asparagineとして、outputのL-asparagineをFig.4cに示すカップルドアッセイにより蛍光検出するPOS系を構築することで、Gln->Asn代謝経路を阻害する化合物を生理活性既知の1600化合物のライブラリーから探索した(Fig. 4c, d)。得られたヒット化合物のうち、化合物2と化合物3はGln->Asn代謝経路に関わる代謝物の細胞内量を減少させると共に(Fig. 4e)、がん細胞(A549)に対して強いViability抑制効果を示すことが確かめられた(Fig. 4f)。

[総括]
代謝活性を評価する新たな生細胞ベースのHTS系Pathway-OrientedScreening(POS)法を開発することに成功し、生細胞系で有効な新規MG代謝系阻害剤およびGln->Asn代謝経路阻害剤を取得した。これら新規阻害剤はがん細胞に対して有意に強くViabilityを抑制することが分かり、新たな代謝活性制御型の抗がん剤候補としての発展が期待される。さらに、POS法は任意のinputとoutputを選択することで様々な代謝経路について評価可能であり、用いる細胞も遺伝子導入等の特別な処理が必要ないため、高い汎用性が期待される。

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