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1分子酵素活性プロファイリングによる疾患関連酵素の超高感度検出

坂本, 眞伍 東京大学 DOI:10.15083/0002007117

2023.03.24

概要





















坂本 眞伍

坂本眞伍は「1分子酵素活性プロファイリングによる疾患関連酵素の超高感度検出」
と題し、生体サンプル中に存在する多数の酵素を微小なウェル中に1分子ずつ分画し、そ
の活性を指標としてそれらを識別・高感度に検出する方法論の開発を行った。
生体サンプル中の酵素活性検出における感度の向上は、特に疾患の早期発見や新規バイ
オマーカーの発見に大きく資すると期待される。酵素活性検出の超高感度化を実現し得る
技術としては、多数のマイクロウェルに酵素を1分子ずつ分画し、蛍光プローブのようなレ
ポーター分子を用いてその活性を検出する1分子計測法を用いた手法が開発されてきた。
しかしながら、血液、尿のような多数の酵素種が含まれる生体サンプル中の酵素活性検出に
本手法を適用する場合、各酵素はマイクロウェル内にランダムに封入されてしまうため、ど
のウェルに何の酵素が入っているかを知ることができないという問題が指摘されていた。
特に疾患関連酵素として知られ、疾患のスクリーニングにも利用されている alkaline
phosphatases (ALPs) のように、類似の活性を持つ酵素群(アイソザイム)が存在する酵素
種を検出する場合においては、これらの酵素を区別して検出することが出来ないことが、生
体サンプルを利用した酵素の検出に制限を与えている。
これに対し本研究では、ウェル中に含まれる1分子の酵素を、異なる反応点と異なる蛍
光波長を有する複数の蛍光プローブに対する反応性の組み合わせ(活性パターン)の違い
によって識別するという手法によって上記の問題を解決し、マイクロデバイスを用いた1
分子レベルの超高感度計測という長所を最大限に生かした新規診断プラットフォームを開
発することを目指した。
本研究で坂本はまず、サンプル中の ALP の活性をアイソザイム毎に分離し、検出するこ
とを目的として、ALP 活性検出用の多色の蛍光プローブ群を開発した。そのうち、ALP の
基質となるリン酸エステル部位の構造の異なる2色のプローブを用いて、2種類の ALP ア
イソザイム、小腸型 ALP(ALPI)と組織非特異型 ALP(TNAP)の活性測定を行ったとこ
ろ、それぞれにおいて2色のプローブに対する反応性の組み合わせが異なることを見出
し、溶液中の両アイソザイムを1分子レベルで分離検出することに成功した。さらに、ヒ
ト血清サンプルを用いた測定においても、サンプル中に存在する両アイソザイムをその活
性パターンに基づいて1分子レベルで分離検出することに成功している。また、10 名の検
体由来のサンプル中において、本手法で ALPI として検出された各分子の活性の総和は、
通常の生化学検査で用いられる比色分析によって測定された ALPI の活性値と高い相関を

示した。すなわち本手法を用いて、血液サンプル中の ALP アイソザイムを分離検出し、定
量することが可能であることが示された。
さらに、ALP に限らず、血液中に存在する多様な phosphatase を検出するため、生理的
pH の条件の下、それぞれ異なる酵素認識部位の構造を有する3色の phosphatase 検出用蛍
光プローブを用いて検体由来血清サンプルの測定を行った。その結果、より多種類の異な
る活性パターンを持つ酵素が検出され、これらはクラスター分析により9つのクラスター
に分類された。この測定条件下でも ALPI に由来するクラスターを推定することが可能で
あり、糖尿病患者においてこのクラスターに相当する分子数が有意に増加していることが
見出された。この結果は、糖尿病患者において ALPI の活性が上昇しているという過去の
報告に矛盾しないものである。
更に、本研究では、1分子レベルでの活性パターンに基づいた生体サンプル中の酵素の
プロファイリング技術の確立を受けて、特に早期診断法の確立が求められているすい臓が
んの診断バイオマーカーの探索がおこなわれた。ターゲット酵素としては ectonucleotide
pyrophosphatases/phosphodiesterases (ENPPs)を選択した。ENPPs は細胞外の
nucleotide triphosphate などの基質を加水分解するという活性を有し、7種類のサブタ
イプを持つ酵素である。まず ENPP 活性検出用の多色の蛍光プローブ群を開発し、これを
用いることで血漿サンプル中に存在する ENPPs を 1 分子レベルで検出することに成功し
た。血漿サンプル中で検出された ENPPs に対しその活性パターンに基づいてクラスター分
析を行ったところ、3つのクラスターに分類された。この手法を以って健常者・膵臓がん
患者を含む血漿サンプルを測定したところ、クラスター1に相当する酵素について、膵臓
がん患者における血漿中の分子数の有意な増加が見出された。精製酵素を用いた検討結果
より、この酵素は ENPP3 であると推測されている。ENPP3 は好塩基球の活性化マーカーと
して知られている酵素で、ENPP3 とすい臓がんとの関連は過去に報告されておらず、この
結果は1分子酵素活性プロファイリングによって酵素活性と疾患との新たな関連を見出す
ことのできる可能性を示唆するものである。
以上、本研究では、生体サンプル中に存在する酵素を、1分子毎の複数の蛍光プローブ
に対する反応性の組み合わせに基づいて分離検出する方法論を確立した。さらにこの手法
を用いて、血液中の ALP、ENPP についてアイソザイム・サブタイプのレベルまでで分離検
出することを達成し、疾患と酵素活性との新たな関係性を見出すことが可能であることを
示した。今後は検出対象とする酵素活性や診断対象とする疾患をさらに拡張した研究を進
めることで、より診断において性能の高いバイオマーカーの発見及び新規疾患診断法の確
立が期待される。
以上の業績は、薬学分野における新規診断技術開発に顕著に貢献するものであり、博士
(薬科学)の授与にふさわしいものと判断した。

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謝辞

本研究を遂行するにあたり、ご指導を受け賜りました東京大学大学院薬学系研究科薬品代

謝化学教室、浦野泰照教授に心より感謝申し上げます。非常に多忙な中、研究の進捗や方

針について的確なご指摘、ご提案をして頂き、本成果に繋げることができました。

極めて貴重なご助言を頂きました、花岡健二郎准教授、上野匡助教、小松徹助教に深く感

謝申し上げます。特に小松徹助教は、研究の方針についてのディスカッション、行き詰っ

た際の的確なアドバイスや指導など、貴重な時間を多く割いて頂きました。重ねて深く感

謝申し上げます.

1分子計測技術に関して実験の指導・研究方針に関する議論を中心として共同研究を行っ

て頂いた野地博行教授、渡邉力也主任研究員、張翼博士に深く感謝申し上げます。

ENPPs 活性検出に関してプローブの開発を中心として共同研究を行って頂いた中川秀彦教

授、川口充康講師に深く感謝申し上げます。

すい臓がん患者検体サンプルの提供・検体を用いた実験に対するご指導を中心として共同

研究を行って頂いた本田一文大学院教授、奥坂拓志肝胆膵内科長、植野高章教授に深く感

謝申し上げます。

酵素活性プロファイリングデータの多変量解析に関してアドバイス・ディスカッションを

して頂いた井上大輝博士に深く感謝申し上げます。

常に励まし合い、共に研究を行い、忙しい中で相談相手になってくださった薬品代謝化学

教室の全ての皆様に感謝致します。特に、研究室生活の支えとなってくれた、同期の池野

喬之博士、大野久史君、粕谷有沙博士、溝口舞博士、Nusaiba Hameed さんに深く感謝

致します。

最後に、長い学生生活を支え、応援してくれた家族に心からの感謝を致します。

2021 年 3 月

東京大学大学院薬学系研究科薬科学博士課程薬品代謝化学教室

坂本 眞伍

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