細胞の動的３次元パターニングによるオンチップ臓器へ挑戦

概要

２版

様 式 Ｃ−１９、Ｆ−１９−１、Ｚ−１９ （共通）

科学研究費助成事業  研究成果報告書
平成 ３０ 年

６ 月 ２６ 日現在

機関番号： １３６０１
研究種目： 挑戦的萌芽研究
研究期間： 2015 ∼ 2017
課題番号： １５Ｋ１４２３２
研究課題名（和文）細胞の動的３次元パターニングによるオンチップ臓器へ挑戦

研究課題名（英文）Dynamic three-dimensional cell patterning toward organ-on-a-chip

研究代表者
秋山 佳丈（Akiyama, Yoshitake）
信州大学・学術研究院繊維学系・准教授

研究者番号：８０５８５８７８
交付決定額（研究期間全体）：（直接経費）

3,000,000 円

研究成果の概要（和文）：動物実験を代替する手法として，マイクロ流体デバイスにおける微小組織構築
（Organ-on-a-chip）が注目されている．しかし，そのためには，マイクロ流路内での細胞や微小組織を操作す
るための技術が必要である．本研究では，マイクロ流路内での高度な3次元微小組織構築に向けて，研究者の提
案する「ラベルフリー磁気アセンブリ法」の有用性を検証した．特に，磁石アレイを用いた細胞パターニングお
よび電磁石デバイスを用いた微小組織の操作を実証した．

研究成果の概要（英文）：As an experimental-animal substitution method, micro-tissue construction in
microfluidic devices (Organ-on-a-chip) has been attracted much more attention. Achievement of
Organ-on-a-chip requires to development a manipulation method for cells and micro-tissues in the
microchannel. In this study, the label-free magnetic assembly method that the author proposed was
assessed. We demonstrated label-free cell patterning using a magnet array and label-free magnetic
manipulation of micro-tissues using an electromagnetic device.

研究分野： ナノマイクロシステム
キーワード： 細胞パターニング マイクロ流体デバイス 組織工学 磁気アルキメデス効果

様 式 Ｃ−１９、Ｆ−１９−１、Ｚ−１９、ＣＫ−１９（共通）
１．研究開始当初の背景
多細胞生物は，個体−器官系−器官−組織−
細胞という階層構造を成している．しかし，
現在，創薬スクリーニングにおいては，最下
層である細胞レベルの評価が中心となって
おり，個体レベルの実験動物およびヒトでの
治験結果との隔たりが問題となっている．こ
の問題の解決に向けて，微細加工技術により
作製したマイクロ流体デバイスが注目を集
めている．培養環境を微小化することで，単
純に高価な細胞や試薬の使用量が削減でき，
システムの集積化が容易になるだけではな
く，レイノルズ数の低下により層流条件とな
るため細胞周辺環境の精密な制御が可能と
なる．このようなマイクロ流体デバイスでの
細胞培養に関する研究は，近年急激な発展を
遂げており，高度な流体制御技術や複雑な微
小構造を組み合わせることで，細胞から機能
や構造を持つ微小組織を構築するに至って
いる．さらに，Shuler 教授により，１つの基
板上に複数の組織や器官を作り上げる Organ
on a chip または Human on a chip と呼ばれるコ
ンセプトが提案され，現在最も注目される研
究分野の１つとなっている．これまでに機能
や構造を持つ微小組織の構築が報告されて
はいるが，閉鎖空間であるマイクロ流路内で
の細胞の操作は困難であり，生体同様の複雑
かつ多機能な組織を構築するには至ってい
ない．
２．研究の目的
本研究では，Organ-on-chip における最終ゴー
ルであるマイクロ流路内での高度な 3 次元微
小組織構築に向けて，著者の提案する「ラベ
ルフリー磁気アセンブリ法」の有用性を検証
する．具体的には，ラベルフリー磁気アセン
ブリ法により，磁石アレイを用いた細胞パタ
ーニングおよび電磁石デバイスを用いた微
小組織の操作を実証する
３．研究の方法
(1) ラベルフリー磁気アセンブリ
溶液中の粒子に作用する磁力 F m は以下の式
(1)で表すことができる．

Fm 



p

  m V

20

B 2

(1)

ここで，χp：粒子の磁化率，χm：溶液の磁化
率，V：粒子の体積，μ0：真空の透磁率，B：
磁束密度である．溶液中の粒子に磁場を印加
しても磁化率に差がないため，粒子は磁場か
らの影響を受けない．また，溶液中に磁性粒
子が含まれる場合，(χp -χm)は正となるため，
粒子に対して引力が働く．一方，正の磁化率
を持つ溶液中に粒子が含まれる場合は，(χp
-χm)が負となるため，粒子は相対的に反磁性
体として振る舞い，粒子は磁場から斥力を受
ける．その結果，粒子は磁力の弱い場所に凝
集する．
(2) 細胞パターニング装置概要
実験装置の概要を図 1 に示す．パターニング

に必要な磁場は，横方向に磁化されたネオジ
ム磁石（幅 1 mm，高さ 5 mm，奥行き 30 mm）
を 15 個並べ，間にスペーサとしてアルミニ
ウム（幅 0.1 mm，高さ 3 mm，奥行き 25 mm）
をはさんだ磁石アレイにより作製した．磁石
アレイの上に，ガラスボトムディッシュに枠
を貼り付けることで作製したチャンバを設
置し，その中でパターニング実験を行った．
チャンバは，縦 10 mm，横 10 mm，高さ 5mm
とした．

図 1 磁石アレイの上に設置したチャンバ．
(3) 蛍光ビーズのパターニング実験
細胞と物理的性質の近い直径 15 μm の蛍光ポ
リスチレンビーズを使用して実験を行った．
DPBS（-）に常磁性化合物(Gd-DOTA)を 40 mM，
蛍光ポリスチレンビーズを 4.1×104 個/mL 添
加して蛍光ビーズ懸濁液を作製した．この懸
濁液を 560 μL をチャンバに導入し，常温で 1
時間半静置した後撮影を行った．チャンバー
は，底面の厚み 0.14 mm のものを使用して実
験を行った．
(4) 細胞パターニング実験
マウス繊維芽細胞（3T3）を用いて，蛍光ビ
ーズと同様の実験を行った．細胞懸濁液は，
Gd-DOTA 40 mM を 添 加 し た 培 地 Hank’s
MEM （10%FBS, 1%AB）に，PKH67 Green
Fluorescent Cell Linker Kit（Sigma Aldrich）で
染色した 3T3 細胞を 4.1×104 個/mL になるよ
うに懸濁することで作製した．
(5) 細胞上への細胞パターニング実験
チャンバーへ PKH26 で染色した細胞を播種
し，3 日間培養した．培地を取り除き，PKH67
で染色した細胞を含む細胞懸濁液を 560 µL
導入し，1 時間半静置した．チャンバは底面
の厚みが 0.11 mm のものを使用して実験を行
った．
(6) 電磁石デバイス
本研究で使用する電磁石デバイスの概要図
を図 2 に示す．本デバイスは，2 対のヨーク
とコイルで構成されており，各コイルに電流
を印加することで各ヨークの先端から磁場
が発生する．発生した磁場はヨークの先端か
らチャンバの中央に向かって磁束密度勾配
を生成する．

図 2 電磁石デバイスの概要．
４．研究成果
(1) 蛍光ビーズのパターニング
実験開始から 1 時間半後の様子を図 3a に示す．
また，得られた画像を元に画像処理ソフト
ImageJ により背景の減算をした後 2 値化し，
Adjustable Watershed で分割した上で水平方向
の座標を算出した．スペーサの中心を 0 とし
たときのビーズの水平方向の距離を横軸，ビ
ーズの数を縦軸にプロットしたグラフを図.
3b に示す．約 80 %のビーズが 141 µm の幅に
収まっていた．以上から，本手法により，パ
ターニングが可能であることが確認できた．

図 4 パターニングされた細胞の蛍光像．
(3) 細胞上への細胞パターニング
実験開始から 1 時間半後の様子を図.5 に示す．
写真中で赤色の点が 1 層目の細胞，緑色の点
が 2 層目の細胞である．
パターニング幅は 256
µm であった．以上から，細胞もポリスチレ
ンビーズと同様にパターニングできること
が確認できた．
従来の細胞接着分子のパターニングによる
細胞パターニングでは困難であった細胞上
への細胞パターニングに成功した．また，チ
ャンバ底面を厚みを 0.14 mm から 0.11 mm と
薄くすることでパターニング幅を 256 µm と
狭くすることに成功した．今後，より薄いガ
ラスや樹脂フィルムを底面とすることでパ
ターニング幅をより狭くすることが可能で
あると考えられる．

図 5 細胞上にパターニングされた細胞．

図 3 蛍光ビーズのパターニング. (a)蛍光顕微
鏡像. (b)画像解析によるビーズの分布.
(2) 細胞のパターニング
実験開始から 1 時間半後の様子を図 4 に示す.
図中で緑色の点が細胞，赤い部分がスペーサ
のアルミニウムを示す．画像解析の結果，パ
ターニング幅（約 80 %の細胞が収まる幅）は，
402 µm と蛍光ビーズの結果の 2 倍以上とな
った．原因としては，細胞と蛍光ビーズの磁
化率の違いや細胞は底面までたどり着くと，
接着してしまうことが挙げられる．

(4) 電磁石デバイスの磁場解析
電磁石デバイスにおいて，各コイルに印加す
る電流の大きさを制御することで，ヨークの
中心に設置したマイクロチャンバ内の磁束
密度の分布が変化させることができる．例え
ば，各コイルに位相をπ/2 ずつずらした正弦
波電流を印加すると，図 6 に示すような磁束
密度が最小である点が回転するような磁場
を生成することができる．その結果，スフェ
ロイドはチャンバの中心を回転中心とした
円運動をする．
汎 用 FEM 解 析 ソ フ ト ウ ェ ア (COMSOL
Multipysics 5.1)を用いて印加電流の振幅と角
度を変化させた時の磁束密度分布を解析し
た．印加する電流の概要と各条件における磁
束密度分布を図 6 に示す．

Conference on Miniaturized Systems for
Chemistry and Life Sciences (MicroTAS
2017)（国際学会）.

図 6 各ヨークに印加する電流と磁束密度分
布．
(5) マイクロ流路内での微小組織の操作
微小組織（スフェロイド）を予めチャンバに
導入し，チャンバ中央に配置した．3 時間置
くことで，チャンバ底面に細胞を接着させた．
接着後，新たなスフェロイドを流路に導入し
た．コイルに電流を印加し，チャンバ中央に
固定したスフェロイドに 0 度，
90 度，
180 度，
270 度の方向から，スフェロイドを接着させ
た（図 7）
．固定したスフェロイドに対して，
0 度，90 度，180 度，270 度の方向からスフ
ェロイドを融合させることに成功した．

③

Y. Akiyama, A. Watanabe, “Label-free
Electromagnetic Spheroid Manipulation
Based on the Magneto-Archimedes Effect,”
27th 2016 International Symposium on
Micro-Nano Mechatronics and Human
Science (MHS2016)（国際学会）.

④

Y. Akiyama, J. Sugihara, “Direct muscle
tissue formation between micropillars by
label-free magnetic cell assembly,” The 20th
International Conference on Miniaturized
Systems for Chemistry and Life Sciences
(MicroTAS 2016)（国際学会）.

⑤

秋山佳丈，“ラベルフリー磁気アセンブ
リによるオンチップスフェロイド形成
と融合” 化学とマイクロ・ナノシステム
学会 第 34 回研究会.

⑥

渡辺彬生，秋山佳丈，“閉鎖空間内にお
ける電磁石を利用した微小生体組織の
ラベルフリー磁気操作” 化学とマイク
ロ・ナノシステム学会 第 33 回研究会.

⑦

秋山佳丈，柴田健吾，秋山義勝，大和雅
之, “磁気走査型細胞パターニングデバ
イス開発に向けた基礎的検討” 第 15 回
日本再生医療学会総会.

⑧

Y.
Akiyama,
“Assessment
of
electromagnetic device for label-free
magnetic cell assembly,” International
Conference on Biofabrication 2015（国際学
会．

⑨

秋山佳丈， “ラベルフリー磁気細胞アセ
ンブリによる微小構造体上への直接的 3
次元組織構築,” 日本機械学会 2015 年度
年次大会.

⑩

Y.
Akiyama,
“Three-dimensional
Biofabrication
toward
Biohybrid
Microdevices,” The 15th International
Union
of
Materials
Research
Societies,International Conference in Asia
(IUMRS-ICA)（国際学会）.

図 7 各方向からのスフェロイド操作．
５．主な発表論文等
〔雑誌論文〕
（計 2 件）
① 秋山佳丈，逆転の発想で，細胞を磁場
であやつる，生物工学会誌，査読無，2018,
96, p. 143.
②

秋山佳丈，磁気を使って細胞を任意形状
に配置，ケミカルエンジニヤリング，査
読無，2017, 61, pp. 35-41.

〔学会発表〕
（計 10 件）
① 菱田豊, 秋山佳丈, “磁気アルキメデス効
果を用いた磁気走査型細胞パターニン
グ―3 次元磁気走査システムの構築とそ
の 評 価 ―,” 日 本 機 械 学 会 ロ ボ テ ィ ク
ス・メカトロニクス講演会 2017.

〔産業財産権〕
○出願状況（計 1 件）

②

H. Suenaga, J. Sugihara, M. Horie, Y. ...

この論文で使われている画像