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ウンシュウミカンの Streptococcus mutans におけるう蝕病原性に対する抑制効果の検討

大畑, 隼平 大阪大学 DOI:10.18910/82160

2021.03.24

概要

【緒言】
グラム陽性通性嫌気性細菌であるStreptococcus mutansは、う蝕の主要な原因細菌として知られており、スクロースをもとに粘着性グルカンを産生して歯面にバイオフィルムを形成し、酸を産生することによりう蝕を発生させる。う蝕予防を考えていく上で、S.mutansにおけるう蝕抑制効果を有し、かつ生体にとって安全な物質を検討することが重要である。

近年、果物由来の抽出物にう蝕原性細菌に対する抗菌効果を有するすものが確認されている。果物由来の成分は、人体に悪影響を与えることなく効果を発揮できうることから、新しいう蝕予防物質として着目されている。

日本において広く栽培されているウンシュウミカン（Citrusunshiu）は、柑橘の腐敗の原因となる青カビ菌に対して抗菌効果を示すことが知られているが、う蝕原性細菌に対する抑制効果は明らかになっていない。そこで、本研究ではS.mutansに対する抗菌効果、S.mutansの増殖に対する抑制効果およびS.mutansのバイオフィルム形成に対する抑制効果の分析を行うこととした。

【材料および方法】
１．使用菌株および培養条件
S.mutansの標準株であるMT8148株を用いた。MT8148株はBrain Heart Infusion（BHI）液体培地にて37˚Cで18時間培養後、それぞれの実験に使用した。

２．C.unshiuを用いたう蝕原性抑制効果の分析
１）C.unshiuの各部位を用いた溶液の作製和歌山県海南市の１軒の農家から提供いただいたC.unshiuを外果皮、内果皮、果実および葉に分け、凍結乾燥して粉砕後に100%エタノールに添加し、100mg/mLに調整し使用した。また、各実験における比較対照群としてC.unshiu非添加の100%エタノールを用いた。

２）S.mutansに対する抗菌効果の分析リン酸緩衝滅菌生理食塩水にて1.0×109CFU/mLに調整したMT8148株の菌液に各C.unshiu溶液を1.0mg/mLとなるよう添加し、37˚Cにて12時間反応させた。反応後、菌液をMitis Salivarius Bacitracin（MSB）寒天培地に播種して37˚Cで48時間培養し、コロニー数を計測した。対照群に対する各C.unshiu溶液群のコロニー数の割合を生存率として算出した。

３）S.mutansの増殖に対する抑制効果の分析C.unshiu溶液を10mg/mLとなるよう添加したBHI液体培地に1.0×105CFU/mLのMT8148株を加えて、37˚Cにて18時間培養した。その後、菌液をMSB寒天培地に播種して37˚Cで48時間培養し、培地上のコロニー数を計測した。

４）S.mutansによるバイオフィルム形成に対する抑制効果の分析前処理として96ウェルプレートにヒト唾液をコーティングした後、0.25%スクロース含有BHI液体培地にて1.0×106CFU/mLに調整したMT8148株にそれぞれのC.unshiu溶液を1.0mg/mLとなるよう添加したものを分注した。37˚Cにて18時間培養後クリスタルバイオレット染色を行い、各ウェルのOD595値を計測した。

３．エッセンシャルオイルを用いたう蝕原性抑制効果の分析
これまでに抗菌効果を有することが示されているエッセンシャルオイルを13種類選出した。それぞれのエッセンシャルオイルを1.0mg/mLに調整し、MT8148株における抗菌効果、増殖抑制効果およびバイオフィルム形成に対する抑制効果について分析した。

４．統計学的分析
2群間における統計学的有意差の検定にはStudentのt検定を用い、多群間の比較にはANOVAの後post-hoc解析としてBonferroni法またはDunnett法を用いて行い、有意水準５%以下を有意差ありとした。

【結果】
１．C.unshiuを用いたう蝕原性抑制効果の分析
１）S.mutansに対する抗菌効果の分析C.unshiuのいずれの部位を添加した群においても、MT8148株の生存率は対照群と比較して有意に低下した。外果皮、内果皮および果実を添加した群において強い抗菌効果が認められ、次いで葉を添加した群で抗菌効果が示された。

２）S.mutansの増殖に対する抑制効果の分析C.unshiuを添加した群では対照群と比較して、いずれもMT8148株の増殖が有意に抑制された。外果皮、内果皮および果実を添加した群は著明な増殖抑制効果を示し、続いて葉を添加した群で抑制効果が示された。

３）S.mutansによるバイオフィルム形成に対する抑制効果に関する分析MT8148株によるバイオフィルムの形成は、C.unshiuを添加した群においていずれも対照群と比較して有意に抑制された。外果皮および内果皮を添加した群で顕著な抑制効果が確認でき、次いで果実および葉を添加した群で抑制効果が示された。

２．エッセンシャルオイルを用いたう蝕原性抑制効果の分析
アルデヒド類（シトラール）およびフェノール類（チモール、カルバクロール）は、MT8148株における抗菌、増殖抑制、バイオフィルム形成抑制の全ての効果を示し、フェノール類が特に強い効果を示した。エーテル類（シネオール）は抗菌およびバイオフィルム形成抑制において、アルコール類（リナロール）は増殖およびバイオフィルム形成抑制において有意な効果を示した。炭化水素類においてはγ-テルピネンによる増殖抑制効果およびβ-ピネンによるバイオフィルム形成抑制効果が認められた。

【考察】
本研究において用いたC.unshiuのいずれの部位も、S.mutansに対する抗菌効果、S.mutansの増殖に対する抑制効果およびS.mutansによるバイオフィルム形成に対する抑制効果を示し、特に外果皮および内果皮が著明なう蝕原性抑制効果を有することが明らかとなった。また、C.unshiuに含まれるエッセンシャルオイルにはS.mutansに対するう蝕原性抑制効果を示すものが存在することが確認された。特に、フェノール類であるチモールおよびカルバクロールはS.mutansにおける抗菌、増殖抑制、バイオフィルム形成抑制の全てにおいて強い効果を有することが明らかとなった。これらのことから、C.unshiuの各部位はS.mutansにより誘発されるう蝕の抑制が可能であり、エッセンシャルオイルがう蝕予防効果を有する物質の１つである可能性が示唆された。今後は、C.unshiuのう蝕原性抑制効果における詳細なメカニズムを追究するとともに、C.unshiuもしくはエッセンシャルオイルを配合したう蝕予防効果を有する歯科材料や食品の開発を行い、臨床応用を目指していきたい。

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参考文献

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