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A ROCK Inhibitor Promotes Graft Survival during Transplantation of iPS-Cell-Derived Retinal Cells

Ishida, Masaaki 京都大学 DOI:10.14989/doctor.k23765

2022.03.23

概要

【背景】
加齢黄斑変性症は主要な失明原因の一つであり、ES/iPS-RPE 移植による治療が期待されている。それらの移植手段としてシート移植と細胞懸濁液移植の2 つがあるが、細胞懸濁液移植はシート移植と比較して移植細胞のコントロールが困難である。そこで、今回、ROCK 阻害剤併用角膜内皮細胞懸濁液移植の既報を参考に、ROCK 阻害剤の1 つであるY-27632 がiPS-RPE 懸濁液移植へ応用可能かどうか確かめるべく、invitro, in vivo におけるiPS-RPE に対するROCK 阻害剤の効果を調べる事とした。

【方法】
iPS-RPE に対するY-27632 の作用に関して以下の項目を確認した。①dish 上での細胞接着と細胞増殖、②細胞播種後のアポトーシス、③培養上清中の炎症性サイトカイン (IL-6, CXCL11/I-TAC, CCL2/MCP1,TNF-α)、④MHC class II 分子の発現量、⑤MLR（Mixed lymphocyte reaction）における CD4 陽性T 細胞、CD8 陽性T 細胞と CD11b 陽性細胞の増殖、⑥iPS-RPE と PBMC 共培養 (Lymphocytes-GraftsImmune Reaction test) におけるT 細胞の増殖、⑦iPS-RPE 特異的マーカーの発現変化（VEGF-A, PEDF, RPE65, bestrophin-1, Pax6, tyrosinase）。次に、カニクイザルを用いて、in vivo でのY-27632 の作用を確認した。コントロールとして生理食塩水を右眼に、Y-27632 (10uM) を左眼の2 か所に網膜下投与し意図的網膜剥離 (ブレブ) を作成した。なお、この術前後に局所網膜電図 (focal ERG) を施行した。続いて、iPS-RPE（左眼のみY-27632 を添加）をサル網膜下に移植し、生着の程度を比較した。なおこのサルは、シクロスポリン投与した条件下で飼育した。この他に、MHC match、MHC非match 移植+シクロスポリン＋局所ステロイド投与のサルにおいて、同様の移植を施行した。全てのサルは術後6 か月の眼科一般検査の後、サクリファイスし、組織染色を施行した。

【結果】
Y-27632 添加時にはdish 上でのiPS-RPE の細胞接着、細胞増殖が有意に向上した。またアポトーシスも有意に抑制された。iPS-RPE の炎症性サイトカインは、CXCL11/I-TAC とCCL2/MCP1 がY-27632 添加時に有意に抑制された。またY-27632の容量依存的にCCL2/MCP1 の産生量が減少した。MLR assay において、Y-27632 の容量依存的に、細胞増殖が抑制され、また、IFNγ産生量が減少した。iPS-RPE 特異的マーカーの発現や貪食能は Y-27632 添加の有無で有意な差は無かった。iPS-RPE のMHC class II 発現はY-27632 添加により有意に減少した。LGIR test では、T 細胞増殖は有意に減少した。細胞懸濁液のサル移植時に、Y-27632 添加時には、細胞がシート状に広がり、生着が向上した。網膜毒性を確認する試験では、Y-273632 の網膜下投与による網膜組織の生理学的、解剖学的な変化は、生理食塩水を投与した場合と比べ差は確認されなかった。

【結論】
Y-27632 は、iPS-RPE に対して、細胞増殖効果や、免疫抑制作用があり、またin vivo において、Y-27632 併用iPS-RPE 懸濁液移植は、移植細胞の生着を向上させる効果を期待できると思われる。

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参考文献

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