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Paip2によるPABP依存的翻訳抑制の分子メカニズムの解明 (本文)

寒河江, 彪流 慶應義塾大学

2022.09.05

概要

1.1 Poly(A)結合タンパク質[Poly(A)binding protein C1(PABPC1)]
　真核細胞で合成されたmRNAは、5末端にcapが、3末端にpoly(A)が付加された後、細胞質へ輸送される(1)。Poly(A)がmRNAに付加されると翻訳が促進され、この機構は、poly(A)依存的翻訳と呼ばれる(2)。Poly(A)には、Poly(A)結合タンパク質C1（PABPC1）が複数分子結合し、poly(A)上に一次元の配列を形成し、PABPC1分子あたり24-27塩基を認識している(3,4)。Poly(A)に結合したPABPC1は、翻訳開始因子eIF4G(5)や翻訳終結因子eRF3(6)などの様々な因子をリクルートすることにより、poly(A)依存性な翻訳において重要な役割を担っている。
　PABPC1の発現は、細胞やウイルスの増殖と正の相関がある。例えば、ヒトやマウスの心臓の細胞は生後すぐに増殖し、その間にPABPC1の発現が亢進する。細胞の成長後は、細胞増殖が抑制され、PABPC1の発現は減少する(7)。また、細胞増殖が活発な大腸がん細胞では、PABPC1のmRNAの量が上昇している(8)。デングウイルス等のウイルスは、宿主細胞内のPABPC1を利用してウイルス由来のRNAを翻訳し、その結果、ウイルスが増殖する(9)。また、サイトメガロウイルス感染細胞ではPABPC1が蓄積していることも報告されている(10)。

1.2 PABP interacting protein 2 A(Paip2A)
　PABPC1結合して翻訳を調節するタンパク質のうち、Paip2AはPABPC1をpoly(A)から解離させることでpoly(A)依存的な翻訳を抑制する(11)。Paip2Aの発現により、恒常的にがん化したNIH3T3細胞の増殖が抑制されることや(12)、Paip2Aの細胞内濃度が上昇すると、デングウイルスやサイトメガロウイルスの複製が抑制されることが知られている(9,13)。このようなPaip2Aの機能は、Paip2AがPABPC1をpoly(A)から解離させる機構により達成されるものと考えられ、Paip2Aによるpoly(A)からのPABPC1の解離の分子機構が解明されれば、新たな抗がん剤や抗ウイルス剤を開発に繋がることが期待できる。

1.3 PABPC1とPaip2Aのドメイン構成と機能
　PABPC1は636残基の塩基性タンパク質で、分子量は71kDaである（図1）。N末端には4つRNA認識モチーフ（RRM）があり、それぞれが約90残基からなる。C末端には75残基のPABCドメインがあり、RRMとPABCの間は170残基のリンカー領域でつながっている(14)。RRM領域はPABPC1のpoly(A)結合能を担っており、4つのRRM（残基1-370、以降、RRM1/2/3/4と表記する）のpoly(A)との相互作用の解離定数(Kd)は約0.15nMであり、PABPC1全長のKd(0.69nM)と同程度である(15)。これまでに、PABPC1のRRM1とRRM2（残基1-190、以降、RRM1/2と表記する）と9塩基のpoly(A)(A9)の複合体の結晶構造が報告されており(16)、各RRMは2つのαヘリックスと4本鎖のβシートから構成されている。2本のα-ヘリックスはβ-シートの側面に位置し、poly(A)はα-ヘリックスの反対側でβ-シート表面に結合する(16)。
　Paip2Aは127残基からなる分子量15 kDaの酸性タンパク質で（図1）、N末端とC末端にそれぞれPABP-interacting motif1(PAM1)とPABP-interacting motif 2(PAM2)という2つのPABPC1相互作用モチーフを持っている(17)。Paip2AとPABPC1との相互作用のKdは約0.66nMと報告されている。PAM1は主にPABPC1のRRM2-RRM3領域に結合する(17)。一方、PAM2はPABPC1のC末端のPABCドメインに結合し、そのKdは74-400nMである(17,18)。PAM2-PABC相互作用はPaip2Aの機能にも関与しているが(18)、PAM1とPAM2のPABPC1に対するKd値が100倍以上も違うことから、PABPC1とPaip2Aの結合にはRRM領域とPAM1の相互作用が大きな役割を担っていることが示唆される。特に、RRM領域がPABPC1のpoly(A)結合を担っていることから、Paip2AがPABPC1をpoly(A)から解離させる機能には、PAM1のRRM領域への結合が重要な役割を果たしている(17)。

1.4 本研究の目的
　PABPC1のpoly(A)およびPaip2Aへの結合親和性はどちらも約0.7nMとほぼ同等であるにもかかわらず、どのようにしてPaip2Aが効率的にPABPC1をpoly(A)から解離させているかは未だ明らかになっていない。そこで本研究では、PABPC1とpoly(A)、および、Paip2AとPABPC1との相互作用を解析することで、Paip2によるpoly(A)からのPABP解離のメカニズムを明らかにすることを目的とした。

1.5 研究の概要
　まず、表面プラズモン共鳴(SPR)法を用いて、調製したPaip2Aの活性確認を行った。24塩基のpoly(A)(A24)[以降、n塩基のpoly(A)をAnと表記する。]を固定化したセンサーチップにPABPC1を添加してA24にPABPC1を結合させた後、さらにPaip2Aを添加した。その結果、Paip2Aの添加に伴い、濃度依存的にPABPC1がpoly(A)から解離し、Paip2AがPABPC1をpoly(A)から解離させる活性を持つことが示された。
　次に、核磁気共鳴分光法(NMR)によるPaip2AとRRM1/2/3/4の相互作用解析を行った。[2H,15N]Paip2Aに対してRRM1/2/3/4を滴定し、RRM1/2/3/4の滴定に伴う[2H,15N]Paip2Aの1H-15NTROSYスペクトル上に観測された主鎖アミドシグナルの変化を解析した。その結果、Paip2Aのアミノ酸残基番号26‒83番の残基に由来するシグナルに大きな化学シフト変化が見られ、Paip2Aのアミノ酸残基番号26‒83番の領域がRRM1/2/3/4との相互作用に寄与していることが示唆された。
　次に、等温滴定カロリメトリー(ITC)によるpoly(A)とRRMとの相互作用解析を行った。その結果、RRM2およびRRM3はA7との結合による熱量変化が観測され、Kdは、それぞれ、200μMおよび4.7μMであった。RRM1およびRRM4はA7との結合による熱量変化は観測されなかった。次に、ITCにて、Paip2Aのアミノ酸残基番号25-83番から成る変異体であるPaip2A(25-83)と単独の各RRMとの相互作用解析を行った。その結果、RRM2およびRRM3はPaip2A(25-83)との結合による熱量変化が観測され、Kdは、それぞれ、4.0μMおよび1.3μMであった。RRM1およびRRM4はPaip2A(25-83)との結合による熱量変化は観測されなかった。
　次に、[15N]Paip2A(25-83)に対するRRM2およびRRM3のNMR滴定実験を行い、1H-15NHSQCスペクトル上に観測された主鎖アミドシグナルの変化を解析した。その結果、RRM2の添加ではPaip2A(25-83)のC末端側の残基である44‒70および74‒79番の領域に、RRM3の添加ではPaip2A(25-83)のN末端側の残基である27‒70番の領域に、化学シフト変化が見られ、Paip2A(25-83)のN末端側がRRM3に、C末端側がRRM2との相互作用に関与することが示唆された。
　次に、NMRにて、poly(A)の添加に伴うRRM2/3の1H-15NHSQCスペクトル上に観測された主鎖アミドシグナルの変化を解析し、A12の添加により大きな化学シフト変化が見られたシグナルに対応する残基をRRM2およびRRM3の構造上にマッピングした。その結果、　それらの残基は、RRM2/3の各RRMのβシート側に局在しており、RRM2/3の各RRMのβシート側にpoly(A)が結合することが示唆された。
　次に、NMRにて、Paip2A(25-83)の添加に伴うRRM2/3の1H-15NHSQCスペクトル上に観測された主鎖アミドシグナルの変化を解析し、Paip2A(25-83)の添加により大きな化学シフト変化が見られたシグナルに対応する残基をRRM2およびRRM3の構造上にマッピングした。その結果、それらの残基は、RRM2/3の各RRMのβシート側に局在しており、RRM2/3の各RRMのβシート側、すなわち、RRM2/3のpoly(A)結合部位にPaip2A(25-83)が結合することが示唆された。
　最後に、本研究で得られた結果をもとに、Paip2Aによるpoly(A)からのPABP解離の構造メカニズムについて考察した。

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参考文献

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