DSE-FRET assayを用いたDNA結合タンパク質の阻害剤探索
概要
博 士 論 文
DSE-FRET assay を用いた
DNA 結合タンパク質の阻害剤探索
広島大学大学院医歯薬保健学研究科 医歯薬学専攻
薬学専門プログラム 細胞分子生物学研究室
城間
喜智
目次
略語…………………………………………………………………………………………………...3
序論…………………………………………………………………………………………………...4
1. 実験方法……………………………………………………………………………………….....8
1.1. 細胞培養……………………………………………………………………………………..8
1.2. DSE-FRET…………………………………………………………………………………..9
1.2-1. DSE-FRET の原理…………………………………………………………………….9
1.2-2. 使用 oligo の配列および duplex の作成……………………………………………10
1.2-3. NF-kB および TRF2 の精製………………………………………………………..12
1.2-4. タンパク定量………………………………………………………………………….16
1.2-5. DSE-FRET assay…………………………………………………………………….17
1.3. In silico 解析……………………………………………………………………………….18
1.4. PK8 細胞からの核抽出…………………………………………………………………….19
1.5. Electrophoretic mobility shift (EMSA) assay ………………………………………...20
1.6. Surface Plasmon Resonance (SPR) 解析………………………………………………23
1.7. ウェスタンブロット解析…………………………………………………………………23
1.8. 細胞増殖曲線………………………………………………………………………………25
1.9. コロニーフォーメーションアッセイ……………………………………………………25
1.10. Prestoblue を用いた細胞生存率の測定……………………………………………….25
1.11. FISH 解析………………………………………………………………………………….26
2. 結果……………………………………………………………………………………………..28
2.1. NF-kB(RelA)阻害剤の探索……………………………………………………………….28
2.1-1. In silico 解析と DSE-FRET を用いた RelA 特異的な阻害剤の探索…………….28
2.1-2. 化合物 A55 は RelA に直接結合することで RelA-DNA 結合を阻害している…31
2.1-3. 化合物 A55 は RelA 特異的な阻害剤である………………………………………..33
2.1-4. 化合物 A55 は RelA の Arg41 と Gln119 を介して結合していると予測された…35
2.2. TRF2 阻害剤の探索………………………………………………………………………..36
2.2-1. TRF2-DNA 結合の評価をするために DSE-FRET を最適化した……………..…36
2.2-2. TRF2 阻害剤の探索…………………………………………………………………...37
2.2-3. TRF2 阻害剤#198 はがん細胞の増殖を抑制した………………………………….42
2.2-4. TRF2 阻害剤#198 はがん細胞に DNA 損傷を与え、
細胞死を誘導した………….44
3. 考察と結論………………………………………………………………………………………47
参考文献…………………………………………………………………………………………….49
謝辞………………………………………………………………………………………………….54
2
略語
DHMEQ
Dehydroxymethylepoxyquinomicin
EMSA
Electrophoretic mobility shift assays
DSE
DNA strand exchange
FRET
Fluorescence resonance energy transfer
HTS
High-throughput screening
NF-κB
Nuclear factor-κB
PDAC
Pancreatic ductal adenocarcinoma
RHD
Rel homology domain
SPR
Surface plasmon resonance
TBS
Tris-buffered saline
PDB
Protein data bank
IC50
Half maximal inhibitory concentration
TRF1
Telomeric repeat binding factor 1
TRF2
Telomeric repeat binding factor 2
ALT
Alternative of lengthening telomere
3
序論
がん治療の標的となる DNA 結合タンパク質
DNA 結合タンパク質は細胞の性質決定に重要なタンパク質である。その中でも転写因子
は多くのがん細胞において発現が亢進しており、がんの悪性化に寄与している。特に転写
因子 nuclear factor kB (NF-kB)はがん細胞の組織浸潤・転移や血管新生、増殖の促進、薬
剤耐性獲得などに関与しており、抗がん剤の分子標的として注目されている 1, 2。また、転
写因子以外にも治療標的となる DNA 結合タンパク質がある。染色体末端であるテロメアに
結合するタンパク質 telomeric repeat binding factor 2 ( TRF2 )は肺、肝臓、胃、子宮頸部
のがん細胞で発現が上昇しており、TRF2 の過剰発現は発がん性を亢進させ、がんの悪性化
に寄与している 3。
転写因子 NF-kB
NF-kB は免疫や炎症、ストレス応答など様々な生体反応に重要な機能を持つ転写因子であ
る 4。興味深いことに、多くの癌において NF-kB タンパク質が恒常的に活性化しており、
悪性化に寄与していることが知られている ( Figure 1 )。転移に関しては、 matrix
metalloproteinases (MMPs)や urokinase types of plasminogen activator (uPA)、そして
Interleukin-8 (IL-8) などが NF-kB によって転写活性化されることが報告されている 5, 6。さら
に細胞周期を調節するサイクリン D1 や c-MYC
血管新生因子の VEGF 10、抗アポトーシ
7-9、
ス遺伝子である inhibitors of apoptosis proteins (IAP) 11, 12 や FADD-like IL-1β converting
enzyme inhibitory protein (FLIP) 13, 14 の発現に関しても NF-κB が関与している。
Figure 1: がんの悪性化に関わる NF-kB の機能
4
NF-kB 阻害剤
そのため、NF-kB は癌治療の標的因子として注目されてきた。既に臨床で用いられている
薬の中にも NF-kB を阻害する作用を持つものとしてクルクミンやアスピリンなどが上げら
れる 15-17。しかし、これらの NF-kB 阻害作用は特異性が低い。一方、NF-kB 阻害剤として
開発された dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ) や NF-kB デコイオリゴなど
がある。
梅澤らが開発した DHMEQ は NF-kB の二量体化や DNA 結合を担う Rel homology
domain (RHD) に直接結合することで阻害効果を発揮する 18。DHMEQ はグリオブラスト
ーマを移植されたマウスにおいて抗腫瘍効果を示している
19 。NF-kB
デコイオリゴは
NF-kB の DNA 結合を競合的に阻害する 20。したがって既存の NF-kB 阻害剤は NF-kB シ
グナリング全体に影響を与えることが予想される。一方で、NF-kB サブユニット毎の特異
的な阻害剤はいまだに開発されていない。
NF-kB のサブユニット
NF-kB は 5 つのサブユニットで構成され、それぞれ RelA, RelB, cRel, p50 そして p52 が
ある。特に p50-RelA と p52-RelB の二つのヘテロダイマー が主に機能していることが知
られている。p50-RelA のヘテロダイマー が介する経路は古典的経路と呼ばれ、生存、増
殖、炎症、自然免疫に関与する 21。対して p52-RelB は非古典的経路と呼ばれ、B 細胞の成
熟やリンパ球新生などの獲得免疫に関わる
22。この理由から、NF-kB
経路全体の阻害は多
くの遺伝子の制御に関わるため、思わぬ作用を及ぼす可能性がある。
RelA の阻害剤を探索する意義
NF-kB の中でも RelA は pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) 患者で多く発現して
おり、腫瘍形成や悪性化に関わっていることが知られ
siRelA によって耐性が失われたことが報告されている
23, 24、ゲムシタビン耐性の細胞株が
25。このように
RelA を阻害する低
分子化合物は膵癌に対する治療効果を増強する薬剤として用いられる可能性がある。
テロメア結合タンパク質 TRF2 について
テロメアは染色体末端部分の TTAGGG の繰り返し配列のことであり、DNA 損傷や染色体
末端結合を防ぎ、染色体の安定性を高めている。一般的に、染色体の末端は DNA の二本鎖
切断の切断部分と同じ形であるために、DNA 損傷だと認識されるが、テロメアは t-loop と
呼ばれるループ構造を取ることによって、物理的に DNA 損傷応答因子が相互作用できなく
させる
26, 27。この
t-loop 構造を形成・維持するために重要な DNA 結合タンパク質複合体
であるシェルタリン複合体がある ( Figure 2 )。この複合体は TRF1, TRF2, TIN2, Rap1,
Pot1 そして TPP1 で構成されている 28-34。これらタンパク質の中でも TRF2 は t-loop の形
成・維持に必須のタンパク質であり、in vitro の実験で TRF2 を欠いたシェルタリン複合体
は t-loop を形成できないことが知られている
5
35。さらに
DNA 結合ドメインを欠失した
TRF2 を発現した細胞においてテロメアにおける DNA 損傷や染色体末端結合が起きる 36-39。
これらの報告から、TRF2 は染色体末端を保護するシェルタリン複合体の中でも必須なタン
パク質である。
Figure 2: テロメアの構造とシェルタリン複合体
TRF2 とがん
さらに、TRF2 はテロメアの保護だけでなく、がんの悪性化にも関わることが知られてい
る。TRF2 は様々ながん細胞で高発現しており、p53 や Wnt/β カテニン、WT1 のシグナル
経路に関わっていることが報告されている 40-42. また TRF2 の高発現は血管新生や免疫逃避
機構を向上させる 43,
44。加えて、マウスモデルにおいて
TRF2 の発現を抑制すると腫瘍形
成が抑えられるため、抗がん治療の標的として注目されている 42, 43, 45。
テロメアを標的とする薬剤
これまでにテロメアを標的とする薬剤について多く報告がされている。例えば、相同組み
換えによるテロメア伸長機構である alternative of lengthening telomere (ALT) を用いて
いるがん細胞においては、VE-821 などの ATR 阻害剤が細胞死を誘導することが知られて
いる 46。またテロメア結合タンパク質に関わる阻害剤としては、Malia blasco らが Ras 経
路の阻害剤が TRF1 の発現を抑制してテロメアでの DNA 損傷を誘導し、がんの幹細胞性を
阻害したことを報告した 47。さらに間接的な TRF2 阻害剤であるテロメスタチンは G4 構造
(DNA の二次構造)を固定することで、TRF2 が物理的にテロメアと相互作用できなくさせ
る 48。テロメスタチンの誘導体は in vivo、in vitro 両方の実験でグリオブラストーマに対
して抗腫瘍効果を示した 49。これらの報告はテロメアを標的とする薬剤の探索はがん治療に
繋がる可能性を示している。
6
DNA 結合タンパク質阻害剤の探索方法
しかしながら、直接的な TRF2 阻害剤や NF-kB サブユニット特異的な阻害剤については
報告がない。その理由として、現在までによく使われている阻害剤のスクリーニング方法
に問題がある。よく使われる方法の一つにルシフェラーゼレポーターアッセイがあり、ハ
イスループット性に非常に優れた方法である。しかし、多くのタンパク質群から一つのタ
ンパク質を区別するのが難しい。例えば、RelA を阻害したとしても他の NF-kB タンパク
質が結合することでルシフェラーゼの発現を上昇させることが可能であるため、RelA 特異
的な阻害剤の探索方法としては適さない。さらに、上述のように下流の遺伝子の転写を活
性化させる転写因子であれば DNA 結合能を評価できるが、TRF2 のように転写活性化能を
持たないとされている DNA 結合タンパク質の評価には適さない。最近では、がんに関連す
る DNA 結合タンパク質を標的とした低分子化合物を素早く簡便に評価できる HTS 方法が
多数開発されてきている 50。我々も 2014 に新しい High throughput screening (HTS)方法
として DNA 鎖交換反応 (DNA strand exchange: DSE)と蛍光共鳴エネルギー転移反応
(Fluorescence resonance energy transfer: FRET) を組み合わせた DSE-FRET 法を開発し
た 51。DSE-FRET はホリデイジャンクションが自発的に DNA 鎖交換を行うことを利用し
ている。ホリデイジャンクションとは、相同組換えなどの多くの種類の遺伝子組換えの重
要な中間体である 4 重鎖の核酸構造である。そしてこのホリデイジャンクションの DSE は
NF-kB や p53、AP1、TRF2 などの DNA 結合タンパク質が阻害することが知られている
52-54。DSE-FRET
は従来の DNA-結合タンパク質と DNA の結合を評価する方法と比べて、
簡便かつ素早く多くのサンプルを一度に評価できるメリットを持つ。さらに精製したタン
パク質を利用できるため、NF-kB サブユニット毎の DNA 結合能を評価でき、遺伝子の転
写などを介す必要がないため、TRF2 の評価も可能である。
本研究の目的
本研究では DSE-FRET assay を用いて NF-kB サブユニットである RelA 特異的な阻害剤
とテロメア結合タンパク質 TRF2 の阻害剤を探索し、それら化合物の機能解析を行うこと
を目的とした。
7
1. 実験方法
1.1. 細胞培養
Table 1: 使用細胞
Cell line
classification
medium
Sf-9
Insect cell line
Sf-900 II
HeLa1.2.11
Human cervical carcinoma
DMEM
PK-8
Human pancreas carcinoma
RPMI
Panc-1
CFPAC
MIA PaCa-2
Human pancreas epithelioid
carcinoma
Human pancreas
adenocarcinoma
Human pancreas carcinoma
RPMI
RPMI
RPMI
Sf-9 細胞は加湿していないインキュベーター ( SANYO ) 内で 28°C に設定し、培養した。
その他の細胞は、5% 二酸化炭素、95% 空気、水蒸気飽和、37°C の条件の下、CO2 イン
キュベーター (SANYO) 内で培養した。
これらの細胞を以下[1]-[3]の培地を用いて維持培養した。
[1] Sf-900II
Sf-900Ⅱ 無血清培地 ( Invitorgen ) に Antibiotic-Antimycotic (100×) liquid ( GIBCO )
を最終濃度 0.1×になるよう添加した培地。
[2] DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium ( DMEM; SIGMA ) に、10% FBS (Hyclone)、0.5 ×
Antibiotic-Antimycotic liquid ( GIBCO ) を添加した培地。血清は 56°C、30 分間処理によ
り非動化したものを使用した。
[3] RPMI
Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium ( RPMI; SIGMA ) に 10% FBS (Hyclone)、
0.5 × Antibiotic-Antimycotic liquid ( GIBCO ) を添加した培地。血清は 56°C、30 分間処
理により非動化したものを使用した。
8
1.2-1. DSE-FRET の原理
DSE-FRET は DNA の鎖交換反応 (DNA strand exchange; DSE 反応)、蛍光共鳴エネル
ギー移動反応 ( fluorescence resonance energy transfer; FRET 反応)、DNA 結合タンパク
質による鎖交換反応の阻害の組み合わせによって行われている。
お互いに相補的なリンカー配列を持っている 2 本鎖の DNA である duplex1 と duplex2
が結合することで、ホリデイジャンクションを形成し、互いの DNA 鎖が交換されること
により最終的に 2 本鎖の DNA が 2 本できるように設計されている。また、DNA 鎖交換
反応は DNA へのタンパク質の結合により阻害される。
以下[1] NF-kB DSE-FRET および [2] telomere DSE-FRET について説明する。
[1] NF-kB DSE-FRET
NF-kB DSE-FRET では duplex1 を構成する DNA oligo の片鎖に蛍光物質、もう一方の
片鎖に消光物質を標識した ( Figure 3 )。このため、鎖交換反応の開始時は蛍光物質と消光
物質の距離が近いため、蛍光値は低く保たれ、鎖交換反応が進行すると時間依存的に蛍光
値が上昇する。本アッセイでは duplex1 と duplex2 に NF-κB の認識配列を導入し、
NF-κB を加えることで鎖交換反応を抑制する性質を利用した。この系に、候補化合物を加
えることで、その化合物の NF-κB の DNA への結合阻害効果を評価した ( Figure 4 )。
Figure 3: NF-κB DSE-FRET assay 原理
Figure 4 : NF-κB DSE-FRET assay の評価法
9
[2] Telomere DSE-FRET
Telomere DSE-FRET では duplex1 の片鎖に蛍光物質、 duplex2 の片鎖に消光物質を標
識している。DNA の鎖交換反応が完了すると、それぞれ標識されている蛍光物質と消光物
質が接近し、FRET 反応が起こり、蛍光強度が時間依存的に減少するように設計した。本
アッセイでは duplex1 及び duplex2 へテロメア DNA 配列を導入した。このときテロメ
ア DNA 結合タンパク質 TRF2 の存在下において DNA の鎖交換反応は阻害される
(Figure 5)。この系に TRF2 とテロメア DNA との結合阻害候補物質を添加した時の反応
の進行度を阻害率として算出し評価した (Figure 6)。
Figure 5: Telomere DSE-FRET assay の原理 Figure 6: Telomere DSE-FRET assay の評価法
※阻害率の計算は Microsoft Excel を用いて行った。
(△ 𝐴 −△ 𝐵)
% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛 =
× 100
(△ 𝐶 −△ 𝐵)
A は化合物を加えたときの蛍光、B は溶媒 (DMSO)を加えたときの蛍光、C はタンパク質を
含まないときの蛍光、Δは最後の蛍光(120 分時)から最初の蛍光(1 分時)を引いた値
※自家蛍光の計算も Microsoft Excel を用いて行った。
𝐴
𝐴𝑢𝑡𝑜𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑐𝑒 =
𝐵
A は化合物と蛍光を発さないオリゴの混合物の蛍光、B は蛍光を発さないオリゴのみの蛍光
1.2-2. 使用 oligo の配列および duplex の作成
本アッセイで使用した oligo の配列を Table2 に示した。
網かけの部分はテロメア配列
( TTAGGG )4 、 ま た は NF-κB の 結 合 配 列
( GGGACTTTCC )を示している。赤または青色で示した配列はリンカー配列であり、同色
の配列は、互いに相補的な配列である。
10
Table 2: oligo の配列
oligo 名
配列
Telomere DSE-FRET
TLM-01-5F
5’ FAM-AGTTGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCAGGCGGTGTCTCGCTCGC-3’
TLM-06
5’-GGGAATGGTGTGGTGCCTGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACTCAACT-3’
TLM-02-3D
5’-GCGAGCGAGACACCGCCTGCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACTCAACT-Dabcyl-3’
TLM-05
5’ AGTTGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGCAGGCACCACACCATTCCC-3’
NF-kB DSE-FRET
NF-kB-01-5F
5’-6FAM-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCGACTCACTATAGGCGGTGTCTCGCTCGC
NF-kB-14-3D
5’ GGGAATGGTGTGGTG CCTATAGTGAGTCGCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-Dabcyl
NF-kB-02
5’ GCGAGCGAGACACCGCCTATAGTGAGTCGCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT
NF-kB-13
5’ AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCGACTCACTATAGG CACCACACCATTCCC
5F: 5’ FAM, 3D: 3’ Dabcyl
Duplex の作成は以下の通り行った。 ...