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大学・研究所にある論文を検索できる 「イヌ変性性脊髄症病因タンパク質の凝集メカニズムと凝集抑制化合物に関する研究」の論文概要。リケラボ論文検索は、全国の大学リポジトリにある学位論文・教授論文を一括検索できる論文検索サービスです。

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イヌ変性性脊髄症病因タンパク質の凝集メカニズムと凝集抑制化合物に関する研究

木村, 慎太郎 岐阜大学

2022.03.14

概要

イヌのスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)関連変性性脊髄症(DM)は高齢で発症する慢性進行性の致死性神経変性疾患である。特徴的な全身骨格筋の進行性麻痺を呈し,発症から約3年で呼吸筋麻痺により死亡する。日本国内ではペンブローク・ウェルシュ・コーギー(PWC)での発症が多く,SOD1遺伝子を変異型ホモ接合体で有することから,変異型SOD1タンパク質がDMの病態に深く関与すると考えられている。したがって,DMの病態発生メカニズムの解明および治療薬開発には変異型SOD1タンパク質の凝集メカニズムの解明が重要であるが,変異型SOD1タンパク質の性状や凝集メカニズムに関する研究は僅かであり,未だ病態の解明には至っていない。本研究では,変異型SOD1タンパク質の凝集メカニズムを解明し,変異型SOD1タンパク質の凝集を抑制する化合物を開発することを目的に研究を行なった。

 第1章では,組換えSOD1タンパク質を作製し,その性状解析を行うことで凝集メカニズムを解明した。タンパク解析ソフトウェアを用いたタンパク質の立体構造モデリングおよび表面電荷の計算を行なった。次に,現在までに報告されている野生型(WT型)および2種類の変異型SOD1タンパク質(T18S型およびE40K型)の活性型(holo型)および金属解離型(apo型)の組換えタンパク質を作製した。円偏光二色性スペクトルを用いて二次構造を測定し,昇温条件下で二次構造の安定性を評価した。各タンパク質にチオフラビンT色素(ThT)を添加し,凝集体形成を継時的に観察した。その後,凝集体の形態を電子顕微鏡を用いて観察した。タンパク質の立体構造モデルより,T18S変異によってダイマー間の疎水性結合が破綻し,内部のシスティン残基が露出することが示唆された。これによって,分子間で新たなジスルフィド結合を有するオリゴマー(SSオリゴマー)が形成される可能性が考えられた。また,E40K-S0D1では表面電荷が顕著に低下していた(Δcharge=2.0)。S0D1タンパク質の二次構造レベルでの安定性はWT型および変異型で変化は認められなかった。しかし,WT型,変異型ともにholo型は安定した構造であるのに対して,apo型では著しく不安定な構造になった。ThTを用いた実験では,apo型SOD1タンパク質に変異が加わることで,凝集が始まることが明らかになった。また,電子顕微鏡による観察ではアミロイド繊維様の凝集体(worm-like fibrils)が認められた。これらの結果より,凝集促進因子として,T18S変異ではSSオリゴマーの形成が,E40K変異では分子表面電荷の低下による分子間力の低下が関与している可能性を明らかにした。また,変異を有するapo型SOD1タンパク質は凝集経路において凝集前駆体として存在し,DM病態に深く関与していることを明らかにし,治療薬開発におけるターゲットになり得ることを示した。

 第2章では,イヌの脊髄組織中のSOD1タンパク質の性状を明らかにした。holo型,分子内ジスルフィド結合(SS結合)を保持したapo型(apoSS型)および分子内SS結合を切断したapo型(apoSH型)の3種類の組換えSOD1タンパク質をそれぞれWT型およびE40K型で作製した。得られた組換えSOD1タンパク質の立体構造の安定性を示差走査型蛍光定量法(Differential scanning fluorometry: DSF)を用いて評価した。次に,E40K-S0D1タンパク質の立体構造を特異的に認識する16G9抗体を検出抗体,各種組換えSOD1タンパク質を抗原としたサンドイッチELISAを行い,16G9抗体の抗原認識アイソフォームを同定した。その後,16G9抗体を用いた免疫沈降およびウェスタンブロットによりDM脊髄組織中の16G9抗体認識抗原を評価した。最後に,DM脊髄中のSOD活性を評価した。DSFによる評価では,第1章の二次構造レベルでの構造安定性と同様に,SOD1タンパク質はWT型,E40K型ともに,apoSS型になることで顕著に不安定な構造となった(熱変性中点(Tm):apoSS-WT-SODl 51.5±0.14°C, apoSS-E40K-S0Dl48.4±0.26°C)。また,apoSH型になることでTmは40°C以下まで低下し(apoSS-WT-SODl38.2±0.55°C, apoSH-E40K-S0Dl31.4±0.38°C),E40K型では犬の生理的体温付近では天然構造を保持できないことが明らかになった。DM脊髄を用いた16G9抗体による解析では,DM脊髄組織中にapoSH-E40K-S0DlおよびE40K-S0D1凝集体が優位に存在することを明らかにした。さらに,DM脊髄中ではSOD活性が低下していることを明らかにした。これらの結果より,DM脊髄中では,構造的に安定で活性を有するholo型の割合が少なく,凝集性を有する不安定なapo型が優位に存在する可能性が示された。

 第3章では,治療薬候補のスクリーニングを行い,銅含有低分子化合物であるCun(atsm)およびオキシインドール誘導体である2種類の化合物(GIF-0854-rおよびGIF-0890-r)が変異型S0D1タンパク質凝集抑制効果を有することを明らかにした。これらの化合物はThTスクリーニングにおいてapo-E40K-S0Dlタンパク質のThT蛍光の上昇を顕著に抑制した。また, S0D1タンパク発現培養細胞でも顕著に凝集体の形成を抑制した。これらの化合物は優れた血液脳関門通過性を有することから,生体内でも効果を示すことが予想され,DMの新規治療薬として期待される。

 本研究はDMの病態に深く関与する変異型S0D1タンパク質の凝集メカニズムを明らかにし,凝集抑制化合物を見出した。今後DMの病態の解明および治療薬を開発する上で本研究成果は重要であり,神経変性疾患に関わる研究のさらなる進展へ広く寄与することが期待される。

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